食品研究与拜发 ２０１２年９月 基础研究 Ｆｏｏｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ 第３３卷第９期 ２１ 猕猴桃根提取物体外抗氧化作用的研究 杨艳杰，何弘水 （漯河医学高等专科学校，河南漯河４６２００２） 摘要：探讨猕猴桃根提取物的体外抗氧化作用。采用ＤＰＰＨ自由基、超氧阴离子、羟基自由基、过氧化氢和还原力的 反应体系，测定猕猴桃根提取物的体外抗氧化作用，并用Ｖ 进行对照实验。实验条件下，ＥＲＨＭ对ＤＰＰＨ自由基、超 氧阴离子（・０２－）、羟基自由基（・ＯＨ）、过氧化氢Ｈ２０２等均有较强的清除或抑制作用，且显示较好的量效关系，同时具 有一定的还原力。其消除ＤＰＰＨ自由基的Ｅｃ 为８．ｏ３ ｍＬ，清除超氧阴离子（・０２－）的ＥＣｍ为１．２８ｍｇ／ｍＬ，抑制羟基 自由基（・ＯＨ）能力可达６９．４％，浓度为１００Ｉｘｇ／ｍＬ时对过氧化氢（Ｈ：０ ）的清除率为４２％。猕猴桃根提取物具有较强 的还原力，能有效清除ＤＰＰＨ和超氧阴离子自由基，并抑制羟基自由基的产生。所以，ＥＲＨＭ有效成分具有较为显著 的抗氧化作用。 关键词：抗氧化作用；清除自由基；还原力；猕猴桃根提取物 Ｋｉｗｉ Ｒｏｏｔ Ｅｘｔｒａｃｔ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ Ｅｆｆｅｃｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＹＡＮＧ Ｙａｎ－ｊｉｅ，ＨＥ Ｈｏｎｇ—ｓｈｕｉ （Ｌｕｏｈｅ Ｍｅｄｃｉａ１ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｌｕｏｈｅ ４６２００２，Ｈｅｎａｎ，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｅｘｐｌｏｒｅ ｔｈｅ ｋｉｗｉ ｆｒｕｉｔ ｒｏｏｔ ｅｘｔｒａｃｔ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｅｆｆｅｃｔ．Ａｄｏｐｔ ＤＰＰＨ ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌｓ，ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ， ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｒａｄｉｃａｌｓ，ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｅｒｏｘｉｄｅ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｆｏｒｃｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ，ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｋｉｗｉ ｒｏｏｔ ｅｘｔｒａｃｔ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｅｆｆｅｃｔ，ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｗｉｔｈ ｖｉｔａｍｉｎ Ｃ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ＥＲＨＭ ｏｎ ＤＰＰＨ， ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ａｎｉｏｎ（・Ｏ２－），ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｒａｄｉｃａｌ（・ＯＨ），ｓｕｃｈ ａｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｈ２Ｏ２ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｒｅ ｓ￣ｏｎｇ，ａｎｄ ｓｈｏｗｅｄ ｇｏｏｄ ｄｏｓｅ—ｅｆｆｅｃｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ，ａｌｓｏ ｈａｓ ｓｏｍｅ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｐｏｗｅｒ．Ｔｈｅ ＥＣｓ０ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＰＰＨ ｒａｄｉｃａｌ ８．０３ ｍＬ，ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ａｎｉｏｎ（・Ｏ２＿）ｉｎ ｔｈｅ ＥＣｓ０ ｏｆｒ ｔｈｅ １．２８ ｍｇ／ｍＬ，ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｒａｄｉｃａｌ （・ＯＨ）ｃａｐａｃｉｔｙ ｏｆ ｕｐ ｔｏ ６９．４％，ｗｈｅｎ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ １００ ｍＬ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｅｒｏｘｉｄｅ（Ｈ２０２）ｉｎ ｔｈｅ ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｒａｔｅ ｗａｓ ４２％．Ｋｉｗｉ ｒｏｏｔ ｅｘｔｒａｃｔ ｈａｓ ｓｔｒｏｎｇ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｐｏｗｅｒ．ｃａｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｒｅｍｏｖｅ ｔｈｅ ＤＰＰＨ ａｎｄ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ａｎｉｏｎ ｒａｄｉｃａｌｓ，ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｒａｄｉｃａｌｓ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ＥＲＨＭ ａｃｔｉｖｅ ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ ｈａｓ ｔｈｅ ｍｏｒｅ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ；ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｆｌｅｅ ｒａｄｉｃａｌ；ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｐｏｗｅｒ；ｋｉｗｉ ｒｏｏｔ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ 氧在生物体内通过单电子还原产生化学性质活 脂质过氧化已成为生命科学领域的一项重要课题。本 泼的物质称为活性氧，包括超氧阴离子自由基（・Ｏｚ－）、 实验从清除ＤＰＰＨ自由基、清除・０：一、清除Ｈ ０ ，抑制 过氧化氢（Ｈ：Ｏ ）、羟基自由基（・ＯＨ）等［１】。活性氧的半 ・ＯＨ、还原力等方面比较猕猴桃根提取物的抗氧化效 衰期很短，但它们可以与多元不饱和脂肪酸作用，造 果，为猕猴桃根生物活性成分的综合开发利用提供科 成脂质过氧化。脂质过氧化是造成生物体氧化损伤的 学依据。 主要原因。不饱和脂肪酸是生物膜的基本组成成分， 极易被活性氧氧化损伤，造成生物膜结构和功能的破 １材料 坏，从而诱发多种慢性疾病圆。因此，消除自由基、抑制 １．１仪器 基金项目：河南省教育厅自然科学研究计划项目（２００９Ｃ１５０００３） ＨＰ８４５３紫外可见分光光度计：美国惠普；ｐＨ２５一Ｓ 作者简介：杨艳杰（１９６５一），女（汉），教授，学士，主要从事食品药品 型酸度计：北京华瑞博远科技公司；８００型离心沉淀器： 分析检测。 河南斯泰仪器有限公司。 杨艳杰，等：猕猴桃根提取物体外抗氧化作用的研究 基础研究 一＝＝２２ ２－３ ＥＲＨＭ对超氧阴离子（・０ ）的清除作用 参考Ｌｉｕ等 的方法检测ＥＲＨＭ对超氧阴离子的 清除能力。取不同浓度的ＥＲＨＭ溶液０－３ ｍＬ分别加入 由１２０ ｐ￣ｍｏｌ／Ｌ的ＰＭＳ、９３６￣ｍｏｌ／Ｌ的ＮＡＤＨ、３００ Ｉｘｍｏｌ／Ｌ １．２试剂 还原性辅酶Ｉ（ＮＡＤＨ），二甲基酚嗪硫酸盐（ＰＭＳ）， 氮四唑蓝（ＮＢＴ），二苯基苦基苯（ＤＰＰＨ），菲洛嗪，氯化 亚铁，氯化铁，亚铁氰化钾（ Ｆｅ（ＣＮ）６］），邻菲咯啉，过 氧化氢，三氯乙酸（ＣＣ１，ＣＯＯＨ），钼酸铵『（ＮＨ ） ＭＯＯ４］， 硫代硫酸钠（ＮａＳ Ｏ ），碘化钾，淀粉，Ｖ ，硫脲，乙酸乙 酯，无水乙醇。试剂均为分析纯，实验用水为重蒸馏水 （ｄｄＨ，Ｏ）。 的ＮＴＢ溶液（均用０．１ ｍｏｌ／Ｌ的ｐＨ＝７．４的磷酸盐缓冲 溶液配制）各０．７５ ｍＬ所建立的反应体系中，混匀，室 温静置反应１０ ｍｉｎ，于５６０ ｎｍ处测定吸光度值Ａ。；以 ６５％乙醇代替ＥＲＨＭ，５６０ ｎｍ处测定Ａ。；以磷酸盐缓 冲溶液代替ＰＭＳ溶液，在５６０ ａｍ处测定Ａ ；６５％乙 醇调零。均平行测定３次。对超氧阴离子清除率和ＥＣ册 的计算方法同前。ＥＲＨＭ对超氧阴离子具有较强的清 除作用，在１．０、２．０、３．０、４．０、５．０ ｍｇ／ｍＬ时，清除率分别 是３５＿５７％、４８．６５％、６６．７４％、７２．１１％、７６．１８％，ＥＣ５０为 １．２８ ｍｇ／ｍＬ。 ２方法与结果 ２．１样品（猕猴桃根提取液）制备 猕猴桃根１０ ｋｇ切碎，８０℃以下烘干至水分小于 １０％，粉碎小于２０目，用乙醇（６５％）４５℃以下回流提 取３次，提取液于５０℃减压浓缩，得约３００ ｇ深黄色流 浸膏，然后取２００ ｇ膏状物，加入适量蒸馏水，搅成糊 状混合液，依次用乙酸乙酯萃取３次（每次５００ ｍＬ）， ２．４ ＥＲＨＭ对羟基自由基（・ＯＨ）的抑制能力 参考Ｆｅｎｔｏｎ反应体系［５１检测ＥＲＨＭ抑制羟基自由 基（・ＯＨ）的能力。反应体系组成：６０ ＩｘＬ １．０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｆｅ 溶液，９０ Ｌ １．０ｍｍｏｌ／Ｌ邻菲咯啉溶液，１５０ Ｉ．ｚＬ ０．１２％ Ｈ２ｏ 溶液，２．４ ｍＬ ｐＨ＝７．８的磷酸盐缓冲溶液，分别加 入不同浓度的ＥＲＨＭ溶液３００ ＩｘＬ，混匀，室温反应 ２０ ｍｉｎ，５１０ ｎｍ处测定Ａ ；６５％乙醇代替抗氧化剂，测 定Ａ。；ｐＨ＝７．８的磷酸盐缓冲溶液代替邻二氮菲，测定 Ａ ，６５％乙醇调零。均平行测定３次。清除率及ＥＣ卯计 算方法同前。结果见图２。 １００ 合并提取液，减压回收溶剂得猕猴桃根提取固体，用 ６５％乙醇精确配制成浓度分别为５．Ｏ、１０．０、２０．０、４０．０、 ６０．０、８０．０、１００．０、２００．０、４００．０、６００．０、８００．０ 咖Ｌ和１．０、 ２．０、３．０、４．０、５．０ ｍｇ／ｍＬ的样品（ＥＲＨＭ）溶液。 ２．２ ＥＲＨＭ对ＤＰＰＨ自由基的消除作用 参考Ａｍａｒｏｗｉｃｚ等［ 的方法测定ＥＲＨＭ对ＤＰＰＨ 的消除作用。０．２５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＤＰＰＨ的６５％乙醇溶液 １．５ ｍＬ与不同浓度的ＥＲＨＭ等体积混匀，室温静置反 应３０ｍｉｎ，于５１７ ｎｍ处测定吸光度值Ａ ；０．２５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＤＰＰＨ的６５％乙醇溶液１．５ ｍＬ与６５％乙醇等体积混 合，５１７ ｎｍ处测定吸光度值Ａ。；不同浓度ＥＲＨＭ与 冰 ８Ｏ 蒋６０ ４０ １．５ ｍＬ ６５％乙醇等体积混合，５１７ ｎｍ处测定吸光度值 Ａ ；６５％乙醇调零。均平行测定３次。计算清除率：清除 ＾ ＾ 烘２０ ０ ０ １ ２ ３ ４ ５ 率＝（１一 ： ）ｘｌ００％。结果见图１。 样品／（ｍｇ／ｍＬ） 图２ ＥＲＩｔＭ对羟基自由基（・０Ｈ）的抑制率 Ｆｉｇ．２ ＥＲＨＭ ｏｆｈｙｄｒｏｘｙｌ ｒａｄｉｃａｌｓ（。ＯＨ）ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｒａｔｅ １００ ８Ｏ 薄６０ ４Ｏ 在０～４ ｍｇ／ｍＬ，ＥＲＨＭ抑制羟基自由基的能力呈 现浓度依赖性。ＥＲＨＭ浓度达５．０ ｍｇ／ｍＬ时，抑制羟基 姆２Ｏ ０ Ｏ ５ １０ ２０ ４０ ８Ｏ 自由基（・Ｏｎ）ｉｆ￣力可达６９．４％，其ＥＣ５０为１．５７ ｍ咖Ｌ。 样品／（Ｉｘｇ／ｍＬ） ２．５还原力比较 图１ ＥＲＨＭ对ＤＰＰＨ自由基的消除活性 Ｆｉｇ．１ ＥＲＨＭ ｅｌｉｍｉｎａｔｅｓ ａｃｔｉｖｅｎｅｓｓ ｔｏ ｔｈｅ ＤＰＰＨ ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌ 参考Ｏｙａｉｚｕ方法［６１依次加入０．７５ ｍＬ磷酸盐缓冲 溶液（ｐＨ＝６．６）、０．７５ ｍＬ １％的Ｋ４［Ｆｅ（ＣＮ）６１、０．７５ ｍＬ不 同浓度的ＥＲＨＭ溶液，混匀，５０℃水浴３０ ｍｉｎ，冰水浴 同时计算清除ＤＰＰＨ的半数有效浓度ＥＣ卯。用Ｖ 作对照，进行平行实验。ＥＲＨＭ对ＤＰＰＨ有较强的清除 作用，且呈现浓度依赖性。Ｖ 的ＥＣ 为７．２ ｇ／ｍＬ， ＥＲＨＭ的ＥＣ５０为８．０３ ｍＬ。 冷却，加入０．７５ ｍＬ １％ＣＣＩ３ＣＯＯＨ，４ ｏＣ下离心１０ ｍｉｎ （３ ０００ ｒ／ｍｉｎ）。取上清液１．５ ｍＬ，加入ｄｄＨ２０ １．５ ｍＬ、１％ ＦｅＣ１ ０．７５ ｍＬ，混匀，室温静置１０ ｍｉｎ，７００ ｎｍ处测定 Ａ ；以ｄｄＨ２０代替ＥＲＨＭ溶液，测定Ａ ｏ；ｄｄＨ２Ｏ调零。 基础研究 杨艳杰，等：猕猴桃根提取物体外抗氧化作用的研究 ２３＝＝＝一 均平行测定３次。以１１０ ｍｇ／ｍＬ Ｖ 在７００ ｎｍ处的Ａ ３讨论 为标准，按下式计算相对还原力：ＲＰ＿鲁 ×ｌ００％， 与较强抑制羟基自由基的产生及消除过氧化氢有关， 本实验结果表明，ＥＲＨＭ具有较强的还原力，这 结果见图３。 １００ ８０ ６０ ４Ｏ 盎２０ ０ ０．０ ０．２ ０．４ ０．６ Ｕ．８ １．０ 样品／（ｍｇ／ｍＬ） 图３ ＥＲＨＭ的相对还原力 Ｆｉｇ．３ ＥＲＨＭ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｐｏｗｅｒ 同时计算ＥＲＨＭ还原力的ＥＣ卯。ＥＲＨＭ还原力较 强，其ＥＣ∞为０．２８ ｍｇ／ｍＬ，约是Ｖｃ（ＥＣ如为０．０８ ｍｇ／ｍＬ） 的３．５倍。 ２．６ ＥＲＨＭ对Ｈ Ｏ 的消除能力 Ｈ ０：是强氧化剂，且易透过细胞膜，并引起氧化 损伤。本实验采用置换滴定法检测Ｈ Ｏ 浓度。取不同 浓度的ＥＲＨＭ溶液各１．０ ｍＬ分别与１＿０ ｍＬ ０．１ ｍｏｌ／ｍＬ Ｈ２０２混合，加入２滴３％的（ＮＨ４）２ＭｏＯ４、２ ｍｏｌ／Ｌ Ｈ２ＳＯ４ １０ ｍＬ、１．８ ｍｏｌ／Ｌ ＫＩ ７．０ ｍＬ，用０．００５ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＳ２０３滴 定，待体系变黄，加入１ ｍＬ淀粉溶液，继续滴定到无色 即为终点。滴定样品试剂的体积为 。，滴定Ｈ ０ 所用 Ｔ， Ｔ， 体积为 。平行滴定３次。计算清除率：ｃ＝ Ｖ０ × １００％。结果见图４。 １ｏｏ ８Ｏ ６０ ４０ 磐２０ Ｏ 样品／（；ｘｇ／ｍＬ） 图４ ＥＲＨＭ对Ｈ：ｏ：的清除率 Ｆｉｇ．４ ＥＲＨＭ ｔｏ ｔｈｅ Ｈ２０２ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｃｌｅａｒａｎｃｅ 结果显示样品ＥＲＨＭ对过氧化氢具有一定的消 除作用，在浓度为１００ Ｉ￣ｇ／ｍＬ时对过氧化氢的清除率 为４２％，比Ｖ 要小（同样条件下Ｖ 清除率为９１％）。 同时也具有消除ＤＰＰＨ和超氧阴离子等活性氧的能 力。实验结果证明了ＥＲＨＭ的多方面抗氧化活性，且 随其浓度增加而增大。所以，ＥＲＨＭ有效成分具有较 为显著的抗氧化作用。 现代研究已经证实，在生命活动的氧化代谢过程 中会不断产生各种自由基，其中超氧阴离子、过氧化 氢、羟基自由基等引起的细胞损伤过程是微粒体脂质 过氧化和多不饱和脂肪酸（ＰＵＦＡ）氧化变性的主要原 因翻。当ＰＵＦＡ遭受到氧化损伤时细胞即失去完整性， 破坏了镶嵌于膜系统上的许多酶的空间构型，使得酶 的空隙扩大、通透性增加，出现退行性变化，从而使内 质网膜、线粒体膜、溶酶体膜等生物膜系统的镶嵌状 态发生变化，导致广泛损伤和病变。自由基一般都不 稳定，寿命很短，检测自由基的清除能力是评价抗氧 化物质抗氧化活性的重要方法。还原力反映了一种物 质作为电子供体的能力，药物还原力和捕获过氧化氢 能力的大小在一定程度上反映了其预防性抗氧化功 能的强弱。 参考文献： 【１Ｊ１ 杨宏杰，陈咸川，郑敏，等．黄芪和丹参清除自由基能力的研究【Ｊ］． 复旦学报：自然科学版；２００３（６）：９３５—９３８ ［２】崔剑，李兆陇，洪啸吟，等．自由基生物抗氧化与疾病［Ｊ］．清华大学 学报：自然科学版，２０００（６）：９—１２ ［３］ Ａｍａｒｏｗ ｉｃｚ Ｒ，Ｎ ａｃｚｋ Ｍ．Ｓｈａｈｉｄｉ ＦＩ Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｖａｒｉｏｕｓ ｆｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｎｏｎ—ｔａｎｉｎ ｐｈｅｎｏ ｌｉｃｓ ｏｆ ｃａｎｏ ｌａｈｕｌｌｓ【ＪＪ．Ｊ Ａ ｇｒｉｃ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ，２０００，４８：２７５５—２７５９ 【４］Ｌｉｕ Ｆ，ＯｏｉＶ Ｅ Ｃ，Ｃｈａｎｇ Ｓ Ｔ．Ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌｓ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｍｕｓｈ ｒｏｏｍ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｅｘｔｒａｃｔｓ［Ｊ］．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ，１９９７，６０：７６３－７７Ｉ ［５】Ｙｕ Ｗ Ｌ，Ｚｈａｏ Ｙ Ｐ，Ｓｈｕ Ｂ．Ｔｈｅ ｒａｄｉｃａｌ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆ Ｒａｄｉｘ Ｐｕｅｒａｒｉａｅ ｉｓｏｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ：Ａ ｃｈｅｍ ｉｌｕｍ ｉｎｅｓｃｅｎｃｅｓｔｕｄｙ［Ｊ１．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ， ２００４，８６：５２５—５２９ 『６】Ｏｙａｉｚｕ Ｍ．Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ｂｒｏｗｎｉｎｇ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ：ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆｂｒｏｗｎｉｎｇｒｅａｃｔｉｏｎｐｒｅｐａｒｅｄｆｒｏｍｇｌｕｃｏｓｅａｍｉｎｅ ｆＪ］．Ｊ Ｐ Ｊ Ｎｕｔｒ，１９８６，４４：３０７—３１５ 收稿日期：２０１２—０１—２６