仪器评介 新型激光诱导荧光检测器的研制及评价 刘翻 孙元社 唐涛 杨长龙 李英杰 李彤 张维冰 （１．齐齐哈尔大学齐齐哈尔１６１００６） （２．大连依利特分析仪器有限公司（３．华东理工大学摘要大连１ １ ６０２３） 上海２００２３７） 采用成本低、灵敏度高的反射式ｚ一型检测池，成功研制新型４７３ｎｍ固体激光诱 导荧光检测器（ＬＩＦＤ）。用荧光物质异硫氰酸荧光素（ＦＩＴＣ）标准品评价检测器性能，其灵 敏度高，最低检测浓度为１×１０。。 ｍｏｌ／Ｌ（Ｓ／Ｎ＝ｌ５），线性范围超过４个数量级。进一步使用 ＦＩＴＣ衍生化苯胺、对甲苯胺、对氯苯胺、联苯胺、对苯二胺等５种物质，评价该检测器， 最小检测量达到Ｐｇ级，重现性好，５种物质保留时间ＲＳＤ值均小于１％（ｎ＝７）。说明该检 测器具有灵敏度高、稳定性好、线性范围宽等特点，适用于环境与生物领域痕量物质检测。 关键词反射式ｚ一型检测池激光诱导荧光检测器 高效液相色谱 引言 荧光检测技术因其具有灵敏度高、荧光性质专 及信息量大等特点，在高效液相色谱系统中得到 导体二极管激光器为光源，采用模块化共聚焦光路 设计。与常规采用气体激光器相比，其使用的半导 体二极管激光器具有稳定性好、价格低和寿命长 等优点；同时它是一种蓝光激光器，发射波长为 ４７３ｎｍ，较现在多使用的红光、红外激光器，拥有 一广泛应用。不同于常规荧光检测器，激光诱导荧光 检测器以激光为光源，采用独特的光路设计，有效 更多荧光试剂与其匹配，因而应用范围更广。 减少散射光，从而大大提高检测灵敏度。检测池是 ＬＩＦＤ２３０的最大特点在于其使用的检测池是一 影响检测器性能的重要单元部件，分析科学家们从 种液相专用，适合于激光诱导荧光检测器的ｚ一型 降低背景光源角度设计多种检测池。最先出现的流 动液滴式无窗口检测池，检测过程中激光直接照射 在液滴上，这种设计虽然消除检测出口的背景光干 扰，但是散射严重。另一种无窗口式检测池——鞘 流池是根据层流原理设计的，优势是将含有样品的 流出液注入到溶剂流的中心，在层流条件下，样品 流和溶剂流不发生？昆合，使溶剂起到保护壳的作用， 同时也减小散射光干扰，Ｋｅｌｌｅｒ研究小组首先利用 鞘流吸收池完成单分子检测 】。这类专用检测池还 包括自由下流射流池和Ｙ．Ｆ．Ｃｈｅｎｇ等提出层流池 。 反射式检测池。普通的无窗口式检测池从减低背景 噪声方面提高检测灵敏度，与之相比，ｚ．型反射 式检测池可以最大限度采集经诱导产生的荧光信 号，从而提高检测器灵敏度。图１为检测池结构图， 液体由１流入，３流出，４为激光入射方向，２为 反射镜片。由于反射镜片２将背离荧光接受光路的 荧光反射到荧光采集系统，有效提高荧光采集效率， 进而提高检测器灵敏度 Ｊ。 ， 在国家科技部专项资金的大力支持下，大连依 利特分析仪器有限公司研制出一种新型激光诱导荧 光检测器——ＬＩＦＤ２３０。检测池采用反射式ｚ一型 设计，在池的后部增加一片反射镜片，将背离荧光 接受光路的荧光反射到荧光采集系统，从而提高荧 ｆ ４ 图１ 反射式ｚ一型检测池结构图 １．液体入１：３；２．反射镜； ３液体出口；４．激光入射方向 光采集效率，提高检测器灵敏度［３】。本文针对该检 测器的设计原理加以说明，并通过与高效液相色谱 联用，对其性ｉｉｉｉ以评价。 ２实验部分 ２．１仪器与试剂 ＬＩＦＤ２３０激光诱导荧光检测器，Ｐ２３０高压恒 流泵，ＺＷ色谱柱恒温箱，ＥＣ２０００色谱工作站， ５５ １ ＬＩＦＤ２３０激光诱导荧光检测器的设计 激光诱导荧光检测器ＬＩＦＤ２３０使用４７３ｎｍ半 现代仪器（ｗｗｗ．ｍｏｄｅｒｎｉｎｓｔｒｓ．ｏｒｇ．ｃｎ） Ｈｙｐｅｒｓｉｌ ＯＤＳ２ ５ ｍ色谱柱，Ｉ．Ｄ．４．６ｍｍ×２５０ｍｍ （大连依利特分析仪器有限公司）；７７２５ｉ手动进样 ｜ 线性范围。结果表明系统在１×１０－８ １×１０ ｍｏｌ／Ｌ ４个数量级范围内具有良好的线性关系（见图３）。 器（Ｒｈｅｏｄｙｎｅ）；电子分析天平（梅特勒一托利多仪 器有限公司）；离心机（长沙市鑫奥仪器仪表有限 公司）。 甲醇（色谱纯，Ｔｅｄｉａ）；异硫氰酸荧光素（ＦＩＴＣ， ９８％，Ｓｉｇｍａ）；硼砂（分析纯，郑州市化学试剂三厂）； 磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、硼酸（分析纯，天津市 科密欧化学试剂开发中心）；苯胺、对甲苯胺、对 氯苯胺、联苯胺、对苯二胺均为分析纯（北京华尔 博科技有限责任公司），实验用水为Ｍｉｌｌｉ—ｅ过滤 超纯水。 ２．２实验方法 ２．２．１ ＦＩＴＣ测试检测器色谱条件 流动相： ０．０５ｍｏｌ／Ｌ的磷酸盐缓冲液（ｐＨ＝８．０）；流量： ３ｍＬ／ｍｉｎ；每个样品进样３次；进样量：２０ Ｌ； —童不接色谱柱进行检测；激发波长（入。 ）／发射中心波 伽 辜长（入。 ）＝４７３ｎｍ／５２５ｎｍ。 ２．２．２苯胺类化合物测试检测器实验方法及色 谱条件取０．０１ｍＬ苯胺类化合物标准品溶液于 １．５ｍＬ离心管中，按照物质的量比为１：７加入 ＦＩＴＣ水溶液，用衍生缓冲溶液（０．０１ｍｏｌ／Ｌ的硼酸 盐缓冲液，ｐＨ＝９．０）稀释至ｌｍＬ，混匀后置于暗处 衍生过夜（２４ｈ）。 色谱柱：Ｈｙｐｅｒｓｉｌ ＯＤＳ２ ５ ｍ色谱柱（Ｉ．Ｄ． ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）；流动相：Ａ：０．０１ｍｏｌ／Ｌ的磷酸 盐缓冲液（ｐＨ＝７．０），流动相Ｂ：甲醇；梯度条件： ｔ／ｍｉｎ，０－２．１０．１３．１５；Ｂ％，４３—４３—５７—５７—４３；流速： １．０ｍＬ／ｍｉｎ；柱温：３５℃；进样量：２０ Ｌ；激发 波长（入 ）／发射中心波长（入。 ）＝４７３ｎｍ／５２５ｎｍ。 ３结果与讨论 ３．１ ＦＩＴＣ测试检测器性能 按照２．２．１中色谱条件测试检测器，噪声Ｅ… 为５７ Ｖ，漂移为９６ Ｖ／ｈ（输出电压１Ｖ，测量范 围０－２０００ｍＶ）；最低检测浓度达到１×１Ｏ－＇２ｍｏｌ／Ｌ （Ｓ／Ｎ＝Ｉ ５），比文献［５］报道的４７３ ｎｍ固体激光诱导 荧光检测器低一个数量级（５×１０。 ｍｏｌ／Ｌ，Ｓ／Ｎ＝５）； 连续３次进１×１０。 ｍｏｌ／ＬＦＩＴＣ溶液的谱图（见图２）， 峰高ＲＳＤ＝０．３９％（ｎ＝３）。不难看出，采用反射式ｚ－ 型检测池、半导体二极管激光器和模块化的共聚焦 光路设计，不仅提高检测器灵敏度，也保证检测器 良好的稳定性。 以一系列ＦＩＴＣ标准溶液为样品，测试检测器 ５６ ● ‘‘ ｓ■ Ｔ ｌ＂ｎ●０ｎ＿） 图２ ＦＩＴＣ谱图（１×１ Ｏ ＾Ⅲ＼ 王『删 ； 。 Ｏ ０ ６ ● ２ Ｃ￣ｍｏｌ／Ｌ） 图３ 线性曲线 ３．２苯胺类化合物测试检测器性能 ３．２．１最小检测量图４为５种物质标准色谱图。 在优化的色谱条件下，测定化合物的最小检测量（见 表１），５种物质的最小检测量达到ｐｇ级。 Ｏ ２ ４ ６ ｅ Ｉｏ ●２ １． 时间／ｍｌ ｎ 图４标准色谱图 １对苯二胺；２苯胺；３联苯胺；４．对甲苯胺；５对氯苯胺 表１ 苯胺类化合物最小检测量 及最低检测浓度（Ｓ／Ｎ＝３） 样品名 最低检测浓度（ｎｍｏｌ／Ｌ）最小检测量（ｐｇ） 以苯胺为代表，对比本文与文献报道其它检测 器方法最低检测浓度（见表２）。本检测器对苯胺 的最低检测浓度比一般ｕＶ法低３个数量级，比荧 ．【∞日＂ Ｏ 仪器评介 光法和安培法约低一个数量级。 表２苯胺的最低检测浓度对比表 分析检测方法 本文ＨＰＬＣ—ＬＩＦ检测法 ４结论 以４７３ｎｍ半导体激光器为光源，采用一种 液相色谱专用，适合于激光诱导荧光检测器的ｚ一 型反射式检测池，研制新型激光诱导荧光检测器 ＬＩＦＤ２３０。 最低检测浓度（ｎｍｏｌ／Ｌ） ２．ｏ０ 离子色谱．安培检测法 电泳一荧光检测法 电泳一激光诱导多光子荧光法 ５３．５９ １０．７４ １２５０．００ 以两类供试样品对检测器进行性能评价。采 用异硫氰酸荧光素，其最低检测浓度低于ｐｍｏｌ／Ｌ， ３。２．２检测器稳定性以ＦＩＴＣ衍生化苯胺、联 苯胺、对甲苯胺、对氯苯胺和对苯二胺浓度均为 １０ｎｍｏｌ／Ｌ的混合标准溶液为试样，考察检测器稳 定性，连续７次进样结果表明其稳定性良好，保 留时间ＲＳＤ值在０．２０％－０．８３％之间，峰面积ＲＳＤ 值在１．０７％～４．２２％之间。 表３苯胺类化合物重复性（ｎ－７） 样品名 保留时间ＲＳＤ（％） 峰面积ＲＳＤ（％） 苯胺 联苯胺０．４５ ０．３３ １．４０ ４．２２ 线性范围超过４个数量级；采用ＦＩＴＣ衍生化苯胺 类化合物，其最小检测量达到ｐｇ级，且保留时间 ＲＳＤ在０．２０％－０．８３％之间（ｎ＝７）。说明该检测器 具有检测灵敏度高、性能稳定、线性范围宽等优势， 非常适于环境与生物领域的痕量物质分析。 参考文献 １ Ｎｇｕｙｅｎ Ｄ．Ｃ．，Ｋｅｌｌｅｒ Ｒ．Ａ．．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｏｆ Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ ｉｎ Ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃａｌｌｙ Ｆｏｃｕｓｅｄ Ｆｌｏｗｓ ｂｙ Ｌａｓｅｒ－ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ．Ａｎａ１．Ｃｈｅｍ．，１９８７，５９：２１５８－２１６１ 对甲苯胺０．２７ 对氯苯胺０．８３ 对苯二胺０．５７ １．０７ ２．４３ １．３２ ２ Ｃｈｅｎｇ Ｙ．Ｆ．，Ｄｏｖｉｃｈｉ Ｎ．Ｊ．．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｚｏｎｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｗｉｔｈ ａ Ｓｈｅａｔｈ Ｆｌｏｗ ＣｕｖｅＲｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ．Ａｎａ１． Ｃｈｅｍ．，１９９０，６２：４９６－５０３ ３．２．３线性范围品，进行分析。 取衍生液Ｏ．０１ｍＬ，用纯水定容 ３杨长龙．博士后研究工作报告，中国科学院大连化学物理 研究所，２００７ 至１．０ｍＬ，混匀。以此溶液为母液，配制一系列样 用选定色谱条件，分别检测它们的色谱图，以 色谱峰面积Ｙ与对应浓度Ｘ（ｎｍｏｌ／Ｌ）作标准曲线， 求出它们的线性方程和相关系数（见表４）。在线 性范围内，５种胺类化合物线性相关系数均大于 ４李彤，杨长龙，张维冰．共聚焦激光诱导荧光检测器用反 射式检测池，２００７１０１５８０４４，２００８ ５杨丙成，谭峰，关亚风．毛细管电泳一４７３ ｎｍ固体激光 诱导荧光检测系统的建立，分析实验室，２００４，２３（１２）： １４－１６ ６朱岩，王幕华，牟世芬．梯度淋洗离子色谱一安培检测测 定苯胺类化合物，分析化学，２００２，３０（７）：７７４￣７７８ ７ Ａｓｔｈａｎａａ Ａ．．Ｂｏｓｅａ Ｄ．．Ｄｕｒｇｂａｎｓｈｉａ Ａ．．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ａｒｏｍａｔｉｃ ａｍｉｎｅｓ ｉｎ ｗａｔｅｒ ｓａｍｐｌｅｓ ｂｙ ｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｗｉｔｈ ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｔ］ｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ，２０００，８９５：１ ９７－２０３ ０．９９，其线性良好。 表４苯胺类化合物的线性关系 ８ Ｃｈｅｎ Ｓ．，Ｘｕ Ｙ．Ｚ．，Ｂｉ Ｙ．Ｈ．．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｐｏｌｌｕｔａｎｔｓ ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｄ ｆｒｏｍ ｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ ｕｓｉｎｇ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈ０ｒｅｓｉｓ ｗｉｔｈ ｍｕｌｔｉｐｈｏｔｏｎ—ｅｘｃｉｔｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｔａｌａｎｔａ，２００６．７０：６３～６７ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｌａｓｅｒ ｉｎｄｕｃｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｏｒ Ｌｉｕ Ｆａｎ ’ Ｓｕｎ Ｙｕａｎｓｈｅ Ｔａｎｇ Ｔａｏ Ｙａｎｇ Ｃｈａｎｇｌｏｎｇ Ｌｉ Ｙｉｎｇｊｉｅ Ｌｉ Ｔｏｎｇ Ｚｈａｎｇ Ｗｅｉｂｉｎｇ ， （１．Ｑｉｑｉｈａｅｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｑｉｑｉｈａｅｒ １ ６ １ ００６） （２．Ｄａｌｉａｎ Ｅｌｉｔｅ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｄａｌｉａｎ １ １ ６０２３） ｆ３．Ｅａｓｔ Ｃｈｉｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ２００２３７） Ａｂｓｔｒａｃｔ Ａ ｌａｓｅｒ ｉｎｄｕｃｅｄ ｌｆｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｏｒ，ｗｉｔｈ ａ ｎｏｖｅｌ Ｚ－－ｙｐｅ ｒｔｅｆｌｅｃｔｉｖｅ ｌｆｏｗ ｃｅｌｌ ａｎｄ ｓｏｌｉｄ－－ｓｔａｔｅ ｄｉｏｄｅ ｌａ－－ ｓｅｒ ｅｍｉｔｔｉｎｇ ａｔ ４７３ｎｍ，ｗａｓ ｉｎｖｅｎｔｅｄ．Ｔｈｅ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｏｒ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｌｉｎｅａｒ ｄｙｎａｍｉｃ ｒａｎｇｅ，ｗａｓ ｅｖａｌｕａｔｅｄ ｂｙ ＦＩＴＣ ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ ｆｉｖｅ ｐｒｅ—ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｅｄ ａｍｉｎｅｓ ａｓ ｔｅｓｔ ｓａｍｐｌｅｓ．Ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔ ｏｆ ＦＩＴＣ ｗａｓ ｌ ｘ ｌ Ｏ。 ｍｏｌ／Ｌ（Ｓ／Ｎ＝ｌ ５）ａｎｄ ｔｈｅ ｌｉｎｅａｒ ｄｙｎａｍｉｃ ｒａｎｇｅ ｗａｓ ｏｖｅｒ ４ ｄｅｇｒｅｅ．Ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔ ｏｆ ａｍｉｎｅｓ ａｃｈｉｅｖｅｄ Ｐｇ ｌｅｖｅｌ ａｎｄ ｇｏｏｄ ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｙ ｔｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ．Ｉｔ ｗａｓ ｃｏｎｃｌｕｄｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ＬＩＦＤ ｈａｄ ｈｉｇｈｌｙ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ，ａ ｗｉｄｅ ｌｉｎｅａｒ ｄｙｎａｍｉｃ ｒａｎｇｅ ａｎｄ ｇｏｏｄ ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｙ．ｔ Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ Ｚ—ｔｙｐｅ ｒｅｆｌｅｃｔｉｖｅ ｌｆｏｗ ｃｅｌｌ Ｌａｓｅｒ ｉｎｄｕｃｅｄ ｌｆｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ ７