１０３６ 重庆医学２０１０年５月第３９卷第９期 ・论 著・ ｐＧＥＸ一４Ｔ一２一ＴＫ原核表达质粒的构建及其表达 钟俐强，杨斯皓，贾钰铭，吴敬波△ （四川省宜宾市第二人民医院肿瘤科６４４０００） 摘 要：目的 构建含胸苷激酶基因（ＴＫ自杀基因）的ｐＧＥＸ一４ ２一ＴＫ原核表达质粒，观察其在大肠杆菌中表达情况，为肿 瘤基因治疗奠定基础。方法 聚合酶链式反应（ＰＣＲ）扩增ＴＫ基因片段，利用性内切酶ＢａｍＨ Ｉ和Ｓａｌ Ｉ将其连接至原核表 达栽体ｐＧＥＸ－４Ｔ一２内，再将连接产物转化入大肠杆菌，挑取单茵落，提取质粒，经ＰＣＲ和双酶切鉴定后测序。将转化正确的大肠 杆菌培养过夜，异丙基一１７ Ｉ＞＆代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导后观察蛋白表达情况。结果 ＴＫ基因片段成功连接至载体ｐＧＥＸ－４Ｔ一２ 中，在大肠杆菌ＢＬ２１中可得到稳定表达的目的蛋白。结论ｐＧＥＸ一４ｒｒ＿２一ＴＫ原核表达质粒构建成功，为后续肿瘤基因治疗研究 奠定了基础。 关键词：自杀基因；质粒构建；聚合酶链式反应 中图分类号：Ｒ７３０．５４；Ｒ４４６．６１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１ ６７１－８３４８（２Ｏ１０）０９—１０３６—０３ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐＧＥＸ－４Ｔ－２－ＴＫ ｐｌａｓｍｉｄ ｉｎ ｐｒｏｃａｒｙｏｔｅ ＺＨＯＮＧ Ｌｉ—ｑｉａｎｇ，ＹＡＮＧ Ｓｉ—ｈａｏ，ＪＩＡ Ｙｕ—ｍｉｎｇ，ｅｔ ａ１． （Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｙｉｂｉｎ Ｓｅｃｏｎｄ Ｐｅｏｐｌｅ￣Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｙｉｎｂｉｎ ６４４０００，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｔｈｅ ｐｌａｓｍｉｄ ｏｆ ｐＧＥＸ ４ Ｔ ２一ＴＫ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ＴＫ ｓｕｉｃｉｄｅ ｇｅｎｅ，ａｎｄ ｔｈｅｎ ｔｏ ｏｂｓｅｒｖｅ ｉｔｓ ｅｘ— ｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ＴＫ ｓｕｉｃｉｄｅ ｇｅｎｅ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｐｌａｓｍｉｄ ｏｆ ｐＯＲＦ ＨＳＶｔｋ ｂｙ ＰＣＲ．Ｔｈｅ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ ｗａｓ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ ＢａｍＨ Ｉ ａｎｄ Ｓａｌ Ｉ．Ｔｈｅｎ ｗｅ ｕｓｅｄ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｄｅａｌ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｖｅｃｔｏｒ ｏｆ ｐＧＥＸ一４Ｔ一２．Ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｗａｓ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｉｎｔｏ Ｅ．ｃｏｌｉ．Ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ＰＣＲ ａｎｄ ｅｎｚｙｍｅ－ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ，ａｎｄ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗａｓ ｍｅａｓｕｅｒｄ．Ｔｈｅ Ｅ．ｃｏｉｌ ｗｉｔｈ ｃｏｒｒｅｃｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｗａｓ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｗｉｔｈ ＩＰＴＧ ｏｖｅｒ ｎｉｇｈｔ ｔｏ ｉｎｄｕｃｅ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ＇ｓ ｅｘｐｒｅｓｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ＴＫ ｓｕｉｃｉｄｅ ｇｅｎｅ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ｃｏｒｒｅｃｔｌｙ ｌｉｇａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｖｅｃｔｏｒ ｏｆ ｐＧＥＸ一４Ｔ一２．Ｔｈｅ ｐｕｒｐｏｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｔａｂｌｙ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｐｌａｓｍｉｄ ｏｆ ｐＧＥＸ一４Ｔ－２一ＴＫ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ．Ｉｔ ｗｉｌｌ ｐｒｏｖｉｄｅ ｔｈｅ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｆｕｔｕｒｅ ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｒｅａｔｉｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｂｙ ｔｒａｎｓｆｅｃｔ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｉｎｔｏ ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｓｕｉｃｉｄｅ ｇｅｎｅ；ｐｌａｓｍｉｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ；ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ 目前放疗与化疗为恶性肿瘤的主要治疗手段，但肿瘤中乏 上游引物：５ 一ＣＧＣＧＧＡＴＣＣ ＡＴＧＧＣＣＴＣＧＴＡＣＣＣＣＧ— 氧细胞的存在是导致放、化疗失败的重要原因。基因治疗的出 ＧＣＣＡＴＣＡＡＣＡＣ ３ ＢａｍＨ Ｉ；下游引物：５．＿ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣ 现给恶性肿瘤的治疗提供了新的思路 ］。ＴＫ基因是近年来 ＴＣＡＧＴＴＡＧＣＣＴＣＣＣＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＧ（、ｒ３ Ｓａｌ Ｉ。 研究最多的自杀基因，全称为人类单纯疱疹病毒胸苷激酶基因 １．２方法 （ＨＳＶ—ｔｋ），可与更昔洛韦（ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ，ＧＣＶ）一起组成ＨＳＶ－ １．２．１ ｐＯＲＦ－ＨＳＶｔｋ、ｐＧＥＸ－４Ｔ一２质粒的抽提 大肠杆菌 ｔｋ／ＧｃＶ自杀基因系统ｌ２ｊ。为此，本实验将ＴＫ基因插入到原 ＤＨ５ａ １ＯＯ“Ｉ 加入５０ ｍＩ Ｉ Ｂ液体培养基，２５０ ｒ／ｍｉｎ ３７℃摇 核表达载体ｐＧＥＸ一４Ｔ一２内，并观察其在大肠杆菌ＢＩ ２１中的 菌过夜。用ＯＭＥＧＡ公司质粒小提试剂盒提取质粒（按说明 蛋白表达情况，为进一步研究将构建好的重组质粒转染厌氧菌 书进行操作）。 （如双歧杆菌）后能否解决肿瘤乏氧区放、化疗抗拒，以为提高 １．２．２ 目的基因片段的扩增及回收 以ｐＯＲＦ－ＨＳＶｔｋ质粒 治疗效果打下基础。 ＤＮＡ为模板，ＰＣＲ扩增ＴＫ基因片段。５０ Ｉ 反应体系中含 １材料与方法 １０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｇ ｐｌｕｓ）５“Ｌ、质粒ＤＮＡ模板１．０ ＦＬ、 １．１材料 ｄＮＴＰ（２．５ ｒａＭ）４ Ｉ 上下游引物各１ Ｉ ＴａｑＤＮＡ聚合酶（２ １．１．１ 质粒与载体 质粒ｐＯＲＦ－ＨＳＶｔｋ购自Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ公 ｕ／ＦＬ）１ ＭＬ。反应参数：９４℃预变性５ ｍｉｎ后，９４℃变性６Ｏ 司，表达型质粒载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－２由四川大学华西医学部公共 ｓ，５５。Ｃ退火９０ ｓ，７２℃延伸７５ ｓ，３５个循环后，７２℃最终延伸 卫生院汪ＪＩｌ老师惠赠，大肠杆菌ＢＩ ２１由四川泸州医学院附院 ２Ｏ ｒａｉｎ。将ＰＣＲ产物进行１ 琼脂糖凝胶电泳，紫外线灯下切 分子生物学中心实验室提供。 割含有目的条带的凝胶块，利用凝胶回收试剂盒进行目的片段 １．１．２主要试剂 质粒小提试剂盒、胶回收试剂盒购自Ｏ— 回收。 ＭＥＧＡ公司；聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增试剂盒、ＢａｍＨ Ｉ、Ｓａｌ Ｉ １．２．３ 目的基因片段与载体连接及鉴定ＢａｍＨ Ｉ、Ｓａｌ Ｉ 性内切酶、Ｔ４ ｄＮＡ连接酶购自ＴａＫａＲａ公司；ＬＢ培养基 性内切酶双酶切目的基因片段和ｐＧＥＸ一４Ｔ一２载体，后在Ｔ４ 购自青岛海博公司；ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳全套试剂盒购自天根生 ｄＮＡ连接酶作用下，１６℃连接过夜，构建ｐＧＥＸ一４Ｔ一２ ＴＫ重 化公司，引物按照分子克隆实验指南引物设计原则，并且加人 组质粒。取连接产物转化至Ｎｉｓｈｉｍｍｒａ法口 制备的大肠杆菌 特定的酶切位点，由赛百盛生物公司合成。 ＢＬ２１感受态细胞中，涂布于含有氨苄青霉素（１００／，ｇ／ｍＩ ）的 ＊ 基金项目：四川省卫生厅科研课题（０３３１）。 通讯作者，Ｅ—ｍａｉｌ：ｗｊｂ６１４７＠ｌ６３．ｃｏｒｎ。 重庆医学２０１０年５月第３９卷第９期 Ｉ Ｂ平板上过夜培养。选取平板上生长状态良好的单个阳性菌 １Ｏ３７ ２．２ 重组质粒的酶切鉴定 重组质粒ｐＧＥＸ一４Ｔ一２一ＴＫ分别 用ＢａｍＨ Ｉ、Ｓａｌ １酶切，切出片段约为１ １００ ｂｐ，４ ９００ ｂｐ，与预 计大小一致，见图２。 落适量扩增后提取质粒ＤＮＡ，行ＢａｍＨ Ｉ、Ｓａｌ Ｉ性内切酶 双酶切后，１ 琼脂糖凝胶电泳观察酶切结果。 １．２．４重组质粒测序将鉴定正确的菌落接种至含有氨苄青 ２．３重组质粒ｐＧＥＸ－４Ｔ ２一ＴＫ测序鉴定ＤＮＡ测序结果与 霉素（１００ ｇ／ｍＩ ）的Ｉ Ｂ液体培养基中扩增．取适量菌液送测 序。测序工作由英骏公司完成。 １．２．５ 目的蛋白在大肠杆菌中的表达 （１）将携带有重组质 ＧＥＮＢＡＮＫ提供的ＴＫ基因序列完全一致，同源性达１００ ， 从第２５个碱基开始为ＴＫ基因序列，第１９～２４碱基为引物的 ５ 端添加的性酶切位点ＢａｍＨ Ｉ，第１６～ｌ８碱基为引物 的５ 端添加的３个保护碱基；第１５碱基之前为载体ｐＧＥＸ－４Ｔ一 ２上的序列。证明ＴＫ基因己成功克隆到克隆载体ｐＧＥＸ一４Ｔ一 ２内，见图３。 粒ｐＧＥＸ一４Ｔ一２一ＴＫ的大肠杆菌接种至５ ｍＩ 含有氨苄青霉素 （１００ ｇｇ／ｍ１ ）的Ｉ Ｂ培养基中３７。Ｃ过夜培养；（２）将过夜菌按 １：５ｏ比例分别接种到５ ｍＩ 含相应抗生素的新鲜Ｉ Ｂ管中， ３７℃剧烈摇动培养１．５～３ ｈ，至菌液的ＯＤ６００ ｎｍ值达到 ０．６～Ｏ．８；（３）加ＩＰＴＧ诱导前从各管菌液中分别取出１ ｍＬ， 保存在４℃冰箱中，作为未诱导对照；（４）在各管菌液中加入 ＩＰＴＧ，使其终浓度为１ ｍＭ，２５℃１５０ ｒ／ｍｉｎ诱导过夜；（５）分 别用１．５ ｍＩ 离心管收集诱导前后样品各１ ｍｌ ，１２ ０００ ｒ／ｒａｉｎ 离心１ ｒａｉｎ，弃去上清液，收集菌体ｌ（６）在菌体沉淀中加入１× ＳＤＳ上样缓冲液（可根据菌体沉淀量相应调整上样缓冲液量）， 重悬混匀，于１ ０（］】Ｃ水浴煮沸６ ｒａｉｎ，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上样前１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心２ ｍｉｎ；（７）取１０～２Ｏ“Ｉ 上清液上样，进行１２ ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳；（８）０．１ 考马斯亮蓝（３－２５０染液 染胶，脱色至蛋白条带清晰可见时，分析蛋白质表达结果。 ２结 果 ２．１ ＰＣＲ扩增目的片段结果将ＰＣＲ产物进行１ 的含ＥＢ 的琼脂糖凝胶电泳，紫外线灯下可见荧光条带，ＴＫ基因片段 约为１ １００ ｂｐ，扩增的片段大小与预计一致，见图１。 ｌ ２ ３ ４ ２∞０ Ｌ∞０ ７５０ ５００ ２５０ ｌＯ０ １～３为ＰＣＲ扩增的ＴＫ基因；４为ＤＩ ２０００ Ｍａｒｋｅｒ。 图１ ＴＫ基因的ＰＣＲ扩增电泳图谱 １ ２ ３ ４ ６Ｏ∞一 ４０∞一 ３ Ｏ∞２∞Ｏ—一— ｌ ５∞一 １ ０００—— ７ｊ０一 ∞ａ一 ２ ０一 ｌ００— １为Ｗｉｄｅ Ｒａｎｇｅ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ（１００～６ ０００）；２～４为连接正确的 重组质粒。 图２ ｐＧＥＸ一４Ｔ一２一ＴＫ重组质粒的双酶切 ＾ ｌ 图３ ｐＧＥＸ－４Ｔ一２一ＴＫ重组质粒测序鉴定部分序列结果 ２．４重组质粒ｐＧＥＸ－４Ｔ－２一ＴＫ在大肠杆菌中的表达 阳性 转化菌经ＩＰＴＧ诱导培养后，行ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳，较 未添加ＩＰＴＧ组可见目的蛋白条带产生，说明作者构建的原核 表达质粒成功，可以表达目的蛋白，达到实验要求，见图４。 ｌ 垒 ３ ４ 鹱 ９４０ ｋｄ ６６ ２ ｋｄ 目的蛋白 ３５ ０ ｋｄ ２６ ０ ｋｄ ∞０ ｋｄ １、３为经ＩＰＴＧ诱导后的蛋白表达；２、４为阴性对照。 图４ ｐＧＥＸ－４Ｔ一２一ＴＫ蛋白在ＢＩ ２１中的表达 ３讨 论 理想的肿瘤基因治疗载体应具备的最重要特性就是对宿 主无毒性以及对肿瘤的高度靶向性 ］。现阶段肿瘤基因治疗 载体系统主要包括病毒载体系统［５ 和非病毒载体系统，病毒载 体系统包括逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体及 单纯疱疹病毒载体，其中腺病毒载体为目前应用最广泛的病毒 载体Ｌ 。其优点是高效转染和高效表达，缺点是腺病毒在感 染增殖较快的肿瘤细胞同时，也会感染机体增殖快的正常细 胞，如上皮细胞，导致一些急性毒性反应，同时由于其自身的免 疫原性，多数人群接触过病毒后体内会产生病毒特异性抗体， 再次应用同一种病毒载体会被首次应用产生的大量免疫中和 抗体所中和；而且给药途径也存在着诸多问题，通过静脉输入 病毒载体是否安全，尚未得到确认，目前临床试验只能靠局部 瘤内注射给药。因此病毒载体的毒性反应、免疫反应及给药途 径了病毒载体在ｌ临床上的应用＿８］。非病毒载体系统包括： 裸ＤＮＡ、脂质体、多聚物及分子耦联体，临床试验中最常用的 是真核细胞表达质粒 ｊ。非病毒载体的优点是安全、制备简单 和携带外源基因较大；缺点是靶向性差，基因导人体内后转染 效率低、表达水平不够理想。 研究表明绝大多数实体瘤因肿瘤实质细胞增生迅速，而血 管形成相当缓慢，造成实体瘤内部大面积缺氧ｌ】 。双歧杆菌 １Ｏ３８ 重庆医学２０１０年５月第３９卷第９期 一＿］一 ］ 属厌氧菌属，能靶向聚集至肿瘤乏氧区域 。在安全性方面， ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ａｓｃｉｔｅｓ［Ｊ］．Ｉｎｔ Ｊ Ｏｎｃｏｔ，２００４，２５ 双歧杆菌对人体来说是肠道益生菌，不会产生不良反应。 （３）：７１３． Ｓａｓａｋｉ等＿ 】将转染前药转换酶基因的长双歧杆菌通过尾静脉 ［５］Ｍａｎｃｈｅｎｏ—Ｃｏｒｖｏ Ｐ，Ｍａｒｔｉｎ Ｄｕｑｕｅ Ｐ．Ｖｉｒａｌ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ 注射到豚鼠体内，未见任何过敏反应出现，也未检测到由双歧 ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ Ｔｒａｎｓｌ Ｏｎｅｏｌ，２００６，８（１２）：８５８． 杆菌介导产生的特殊抗体。因此本实验用双歧杆菌作为基因 ［６］Ｌｉｕ ＸＹ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｇｅｎｅ＿ｖｉｒｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｉｔｓ 治疗运载体将ＴＫ自杀基因靶向运至肿瘤组织，文献报道双歧 ｐｒｏｓｐｅｒｉｔｙ￣Ｊ］．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ，２００６，１６（１１）：８７９． 杆菌自身具有抗肿瘤作用［１３ｔ４］，康保国等 研究表明ＴＫ基 ［７］王稀琴，洪苏玲．重组腺病毒相关病毒载体基因治疗研究 因可经放射诱导表达，可以与放疗产生协同作用，进一步提示 进展【Ｊ］．重庆医学，２００６，３５（２）：１７９． 其是一个很有前途的肿瘤基因治疗运输载体。但双歧杆菌是 ［８］Ｈａｅｋｅｔｔ ＮＲ，Ｋａｍｉｎｓｋｙ ＳＭ，Ｓｏｎｄｈｉ Ｄ，ｅｔ ａ１．Ａｎｔｉｖｅｃｔｏｒ 原核生物，因此必须要原核表达质粒才能在双歧杆菌体内表 ａｎｄ ａｎｔｉｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｈｏｓｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ［Ｊ］．Ｃｕｒｒ 达。基于此，本实验选用了ｐＧＥＸ一４Ｔ一２原核表达质粒，因为该 ０ｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，２０００，２：３７６． 质粒带有非常强的ｔａｃ启动子，融合蛋白表达系统可以克服转 ［９］Ｗｅｃｈｕｃｋ ＪＢ，Ｏｚｕｅｒ Ａ．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｍｅｄｉｕｍ 录与转录后水平对外源基因表达可能带来的不利影响，便于融 ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ，ａｎｄ ｃｅｌｌ ｐａｓｓａｇｅ ｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｒｐｅｓ— 合基因翻译起始，是一种高效的蛋白表达载体，且便于目的蛋 ｂａｓｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ＥＪ］．Ｂｉｏｔｅｃｈ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎ，２００２，７９ 白的进一步分离纯化。目前ＴＫ基因主要与腺病毒基因重组 （１）：１１２． 后，再结合前药更昔洛韦观察体外对肿瘤细胞的杀伤作用，尚 ［１Ｏ］Ｎｕｙｔｓ Ｓ，Ｖａｎ Ｍｅｌｌａｅｒｔ Ｌ，Ｔｈｅｙｓ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ 无ＴＫ基因与ｐＧＥＸ系列载体重组的报道。安丽娜等 。 研究 ｓｐｏｒｅｓ ｆｏｒ ｔｕｍｏｒ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ［Ｊ］．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ 表明，将胞嘧啶脱胺酶（ＣＤ）自杀基因与ｐＧＥＸ载体重组后再 Ｄｒｕｇｓ，２００２，１３（２）：１１５． 转入双歧杆菌，自杀基因能很好表达，对黑色素瘤细胞有较强 ［ｕ］Ｉ ｉ Ｘ，Ｆｕ ＧＦ，Ｆａｎ ＹＲ，ｅｔ ａ１．Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ 的杀伤力。因此将构建好的ｐＧＥＸ一４Ｔ－２ ＴＫ原核表达质粒转 ３８ ａ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａ— 入双歧杆菌后，可望克服病毒载体不能静脉给药的局限，实现 ＰＹ：ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｈｙｐｏｘｉｃ ｔｕｍｏｒ 载体安全性与靶向性的统一。 ｇｒｏｗｔｈ￣Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，２００３，１０（２）：１０５． 本实验构建的ｐＧＥＸ ４Ｔ一２一ＴＫ原核表达载体，经过双酶 ［１２］Ｓａｓａｋｉ Ｔ，Ｆｕｊｉｍｏｒｉ Ｍ，Ｈａｍａｊｉ Ｙ，ｅｔ ａ１．Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉ— 切、ＰＣＲ扩增、测序等鉴定表明重组质粒构建成功，并在大肠 ｎｅｅｒｅｄ Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｆｏｒ ｔｕｍｏｒ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｅｎ— 杆菌ＢＩ ２１内能稳定表达，为进一步研究转入双歧杆菌后能否 ｚｙｍｅ ｐｒｏｄｒｕｇ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ａｕｔｏｃｈｔｈｏｎｏｕｓ ｍａｍｍａｒｙ ｔｕｍｏｒｓ 靶向杀伤恶性肿瘤细胞打下了基础。 ｉｎ ｒａｔｓＥＪ］．Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ，２００６，９７（７）：６４９． （志谢：感谢泸州医学院附属医院肿瘤科放射生物与生物 ［１ ３］Ａｂｄ ｅｌ—Ｇａｗａｄ ＩＡ，ｅｌ—Ｓａｙｅｄ ＥＭ，Ｈａｆｅｚ ＳＡ，ｅｔ ａ１．Ｉｎｈｉｂｉｔｏ 治疗实验室杨玲麟博士及汪碧琼老师对本研究提供的技术性 ｒｙ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｙｏｇｈｕｒｔ ａｎｄ ｓｏｙａ ｙｏｇｈｕｒｔ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ 帮助 ） ｂｉｆｉｄｏｂａｃｌｅｒｉａ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｈｒｌｉｃｈ ａｓｃｉｔｅｓ 参考文献 ｔｕｍｏｕｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｔｕｍｏｕｒ ｍｏｄｅｌ ［Ｊ］．Ｂｒ Ｊ Ｎｕｔｒ，２００４，９２（１）：８ｌ＿ Ｗｅｂｅｒ Ｗ，Ｆｕｓｓｅｎｅｇｇｅｒ Ｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｃｏｎ ［１４］Ｗａｎｇ Ｙ，Ｍａｉ Ｔ，Ｌｉｕ ＭＦ，ｅｔ ａ１．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｌｉｐｏｔｅｉｃｈｏｉｃ ａｃｉｄ ｔｒｏｌ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ［Ｊ］．Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ，２００６，８ ｏｆ Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｏｎ ｓｕｒｖｉｖｉｎ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｇｅｎｅｓ （５）：５３３． ［Ｊ］．Ｚｈｏｎｇｈｕａ Ｚｈｏｎｇ Ｌｉｕ Ｚａ Ｚｈｉ，２００７，２９（５）：３２５． Ｗａｎｇ Ｊ，Ｌｕ ＸＸ，Ｃｈｅｎ ＤＺ，ｅｔ ａ１．Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ［１５］康保国，王卫东，陈正堂，等．放射诱导ＨＳＶ一 ＦＫ基因在 ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ａｎｄ ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ ｓｕｉｃｉｄｅ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ 肺癌细胞中靶向、高效性表达的研究［Ｊ］．重庆医学， ｈｕｍａｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ， ２００７，３６（６）：５０５． Ｚ００４，１０（３）：４００． ［１６］安丽娜，李著华，岳扬，等．婴儿双歧杆菌介导的ＣＤ和 卢圣栋．现代分子生物学实验技术ＥＭ］．２版．北京：中国 ＵＰＲＴ联合５ ＦＣ基因疗法对黑色素瘤的体外治疗实验 协和医科大学出版社，２００１：２９２． 研究Ｆ－Ｊ］．四ＪＩＩ大学学报：医学版，２００７，３８（１）：２７． Ｉｎｏｕｅ Ｍ，Ｍｕｋａｉ Ｍ，Ｈａｍａｎａｋａ Ｙ，ｅｔ ａ１．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｈｙ ｐｏｘｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｒｕｇ ｉｓ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｉｎ （收稿日期：２００９—０８—３０修回日期：２００９ ０９ ２８） （上按第１０３５页） Ｒｅｓ，１９９４，２５（３－４）：２３４． ｅｔ ａ１．Ｐａｔｔｅｒｎ ａｎｄ ｔｉｍｅ ｃｏｕｒｓｅ ｏｆ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ ｇｅｎｅ ｅｘ— ［１５］黄欢捷，邵蓓，郑荣远，等．帕罗西汀对心理应激大鼠下丘 ｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｒａｔ ｂｒａｉｎ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ａｃｕｔｅ ｓｔｒｅｓｓ［Ｊ］．Ｎｅｕｒｏ— 脑室旁核ｃ ｌｏｓ表达的影响［Ｊ］．中国临床药理学与治疗 ｓｅｌｅｎｅ，１９９５，６４（２）：４７７． 学，２００５，１０（３）：２８６． ［１４］Ｈｏｎｋａｎｉｅｍｉ Ｊ，Ｋｏｎｏｎｅｎ Ｊ，Ｋａｉｎｕ Ｔ，ｅｔ ａ１．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｒａｔ ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ ｐａｒａ— （收稿日期：２００９—０９ １５修回日期：２００９—１ｏ－２０） ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｎｕｃｌｅｕｓ ａｆｔｅｒ ｓｔｒｅｓｓ［Ｊ］．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｍｏｌ Ｂｒａｉｎ
