西１２３４ 南农业学报 ２００７年２０卷６期 Ｖｏ１．２０ Ｎｎ ６ Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｃｈｉｎａ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ 文章编号：１００１—４８２９（２００７）０６—１２３４—０３ 辣椒炭疽病３病原核糖体基因 ＩＴＳ区的序列测定及分析 马荣群，黄粤，宋正旭，李梅，岳文辉 （青岛市农业科学研究院，山东青岛２６６１００） 摘要：辣椒炭擅病（ｐｅｐｐｅｒ ａｌｌｔｈｌ＇ａｃｎｏｓｅ）是辣椒生产中的主要病害之一。利用真菌核糖体内转录间隔区（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｐａｃ． ｅｒ。ＩＴＳ）序列通用引物对辣椒炭疽病３病原进行扩增，分别获得其ｒＤＮＡ—ＩＴＳ序列，序列分析结果表明，病菌的５．８Ｓ ｒＤＮＡ序列高度 保守，而ＩＴＳ区的可变性则相对较高。其中ＩＴＳ１区的差异大于ＩＴＳ２区的差异，说明ＩＴＳ１区的变异较丰富，可考虑将该区域作为病 原鉴定的ＰＣＲ检测特异引物的靶序列，为今后各病菌的特异性分子鉴定提供可靠的靶标。 关键词：辣椒炭疽病；核糖体基因；ＩＴＳ；序列分析 中圈分类号：ｓ４３６．４１８．１ １ 文献标识码：Ａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＤＮＡ－ＩＴＳ ｏｆ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｆｏｒ ｐｅｐｐｅｒ ａｎｔｈｒａｃｎｏｓｅ ＭＡ Ｒｏｎｇ—ｑｕｎ，ＨＵＡＮＧ Ｙｕｅ，ＳＯＮＧ Ｚｈｅｎｇ—ＸＵ，ＬＩ Ｍｅｉ，ＹＵＥ Ｗｅｎ—ｈｕｉ （Ｑｉｎｇｄａｏ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｑｉｎｇｄａｏ ２６６１００，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｐｅｐｐｅｒ ａｎｔｈｒａｃｎｏｓｅ ｗａｓ ｏｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｉｎ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ ｐｅｐｐｅｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｔｈｒｅｅ ｆｕｎｇｉ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｏｆ ｐｅｐｐｅｒ ａｎｔｈｒａｃｎｏｓｅ Ｗａｓ ａｍｐｌｉｉｆｅｄ ｂｙ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）ｕｔｉｌｉｚｉｎｇｔｈｅ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｐｒｉｍｅｒｓ ｏｆｉｎｔｅｒｎａｌｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｐａｃｅｒ（ＩＴＳ）ｉｎ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＤＮＡ（ｒＤＮＡ）ａｎｄ ｒＤ— ＮＡ—ＩＴＳ Ｗａｓ ｏｂｔｉａｎｅｄ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎｄｉｃａｔｄｅ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ５．８Ｓ ｒＤＮＡ ｉｎ ｔｈｒｅｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｗａｓ ｈｉｇｈｌｙ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｂｕｔ ｔｈｅ ＩＴＳ ｒｅ－ ｇｌｏｎＷａｓ ｎｏｔ ８０，ａｎｄｔｈｅ ｄｉｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆＩＴＳ１ ｒｅｇｉｏｎｗａｓ ｂｉｇｇｅｒｔｈａｎｔｈａｔ ｏｆＩＴＳ２，ＳＯ１ＴＳ１ ｒｅｇｉｏｎ ｖａｒｉａｔｉｏｎＷａｓ ｖｅｒｙ ａｂｕｎｄａｎｔａｎｄ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ ａｓ ｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉａｌ ｐｒｉｍｅｒｓ ｂｙ ＰＣＲ ｉｎ ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｔｈｏｇｅｎ ａｎｄ ｐｒｏｖｉｄｅｄ ｒｅｌｉａｂｌｅ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｓｅｐｃ￣ｃ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｐｅｐｐｅｒ ａｎｔｈｒａｃｎｏｓｅ． １【ｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｐｅｐｐｅｒ ａｎｔｈｒａｃｎｏｓｅ；ｉｎｔｅｒｎａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｐａｃｅｒ（ＩＴＳ）；ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｌｙｓｉｓ 随着种植业结构的调整，蔬菜种植面积逐年扩 ＰＣＲ技术及相关分子标记技术的应用加快了这一 大，辣椒作为主要蔬菜作物之一被广泛栽培。但是 学科的发展。利用病原菌核糖体内转录间隔区（ｉｎ— 辣椒炭疽病（ｐｅｐｐｅｒ ａｎｔｈｒａｃｎｏｓｅ）是辣椒生产上常见 ｔｅｒｎａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｐａｃｅｒ，ＩＴＳ）基因序列进行病原菌 的一种病害，分布广，危害严重，可引起辣椒落叶、烂 鉴定、分类、检测和病害诊断，已受到越来越多的重 果、幼苗死亡，给辣椒生产造成很大的威胁，严重影 视 Ｊ。本研究利用真菌核糖体内转录间隔区（ 响其产量和品质。 ＩＴＳ）序列通用引物对辣椒炭疽病３病原进行扩增， 在国内，引起辣椒炭疽病的病原主要有３种，根 通过序列比较分析，找出差异，为今后各病菌的快速 据其症状表现可分为黑色炭疽菌（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｎｉ— 特异性分子鉴定提供可靠的靶标。 ｇｒｌｚｍ）、红色炭疽菌（Ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｕｍ ｐｉｐｅｒａｔｕｍ）和黑点 炭疽菌（Ｖｅｒｍｉｃｕｌａｒｉａ ｃａｐｓｉｃｉ）¨Ｊ。近年来，随着分子 １材料与方法 ｔ 生物学技术在植物病理学中的广泛应用，特别是 １．１菌种的分离 ２００５年９月于青岛市农科院辣椒试验田取炭 收稿日期：２ｏｏ７—０４—２４ 疽病症状典型的病果，经ＰＤＡ培养基分离纯化，并 基金项目：青岛市自然科学基金（０５—１－ＪＣ－９１） 作者简介：马荣群（１９７５一），女，硕士，助研，现从事蔬菜病害研 在显微镜下确定分离得到的纯培养与组织切片得到 究，ｔ为通讯作者。 的病原菌在形态上一致，经柯赫氏法则确认后用于 如下试验 Ｊ。 维普资讯 http://www.cqvip.com ６期 马荣群等：辣椒炭疽病３病原核糖体基因ＩＴＳ区的序列测定及分析 ｌ ２ ３ ４ ５ ６ １。２黑色炭疽菌菌丝体ＤＮＡ；３，４红色炭疽菌菌丝体ＤＮＡ；５，６黑 点炭疽菌菌丝体ＤＮＡ １，２ ＤＮＡｆｒｏｍ Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｎｉｇｒｕｍ；３，４ ＤＮＡｆｒｏｍ Ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｕｍｐｉ－ ｐｅｒａｔｕｍ；５，６ ＤＮＡｆｒｏｍ Ｖｅｒｍｉｃｕｌａｒｉａ ｃａｐｓｉｃｉ． 图１辣椒炭疽病３病原菌株基因组ＤＮＡ的电泳图谱 Ｆｉｇ．１ Ａｇａｒｏ￣ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ １．２菌株的培养 将直径为５ ｌｎ／ｎ的菌丝块接种于查氏液体培养 基中，２７℃，１７０ ｒ／ｍｉｎ振荡培养３至５ ｄ，收集菌丝 体备用。 １．３ ＤＮＡ的提取 取０．１ ｇ菌丝体用液氮研磨呈细粉状，加入６００ ｌ提取液（含５０ ｍｍｏＬ／Ｌ Ｔｒｉｓ—Ｃ１，１５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣ１， １００ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ），然后转入１．５ ｍＬ离心管中；迅 速混匀，加入３０ ｌ的２０％的ＳＤＳ，缓慢混匀，３７℃ 水浴１ ｈ；加入９０ ｌ ５ Ｍ的ＮａＣ１，缓慢而充分的混 匀；加入８０ ｌ的ＣＴＡＢ／ＮａＣ１（１０％）混匀，然后６５ ℃水浴１０—２０ ｍｉｎ；加入等体积的酚：氯仿：异戊醇 （２５：２４：１）混匀，１０℃，１０ ０００ ｇ离心ｉ０ ｍｉｎ；取上 清液，加入１／１０体积３Ｍ ＮａＡｃ（ｐＨ５．２）和０．６倍 体积的冷异丙醇，一２０℃下静置３０ ｍｉｎ，４℃下１０， ０００ ｇ离心１０ ｍｉｎ，沉淀用７０％冷乙醇漂洗两次。 真空干燥后，溶于１００ ｔｘｌ的ＴＥ缓冲液中（１０ ｍｍｏＬ／ Ｌ Ｔｒｉｓ。Ｃ１，ｐＨ８．Ｏ，１ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ）一２０℃保存备 用。 １．４核糖体ＤＮＡ ＩＴＳ区的ＰＣＲ扩增 ＩＳＴ区域ＰＣＲ扩增通用引物分别为 Ｊ：ＩＴＳ１： ＴＣＣ ＧＴＡ ＧＧＴ ＧＡＡ ＣＣＴ ＧＣＧ Ｇ，ＩＴＳ４：ＴＣＣ ＴＣＣ ＧＣＴ ＴＡＴ ＴＧＡ ＴＡＴ ＧＣ。ＰＣＲ反应体系为ＰＣＲ扩增 反应体系（２５ １）如下：２ ｔｘｌ ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（每种成分 均为２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ），ＩＳＴ１（１０ ｍｍｏｌ／Ｌ）和ＩＴＳ４（１０ ｍｍｏｌ／Ｌ）各０．５ ｔｘｌ，２．５ ｔｘｌ的１０×Ｔａｑ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆ－ ｅｒ，０．５ ｔｘｌ Ｔａｑ ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（２．５ Ｕ／ １），模板 ＤＮＡ为２ ｔｘｌ（含５ ｎｇ ＤＮＡ），１７ ｌ灭菌双蒸水。 ＰＣＲ循环设置如下：９４℃变性５ ｍｉｎ；９４℃变性４０ Ｓ，５６℃退火４０ Ｓ，７２℃延伸１ｍｉｎ，共设３５个循环； 最后７２℃延伸１０ ｍｉｎ。所用试剂及引物购自上海 生工生物工程有限公司。扩增反应在 Ｃ２ｏ０热循 环仪上进行，ＰＣＲ产物在１．５％琼脂糖凝胶１× ＴＡＥ缓冲液中电泳分析，ＥＢ染色后用凝胶成像系 统分析。 ５００ｂｐ ７５０ｂｐ １ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ；２，３，４分别为３菌株的ＰＣＲ产物 １ ＤＮＡ Ｍ￣ｋｅｒ；２，３，４ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｆｏｒ ｒＤＮＡ ＩＴＳ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｓｔｒａｉｎｓ 图２辣椒炭疽病３菌株ｒＤＮＡ ＩＴＳ片段ＰＣＲ扩增产物 琼脂糖电泳分析 Ｆｉｇ．２ Ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｆｏｒ ｒＤＮＡ ＩＴＳ ｆｒｏｍ ｔｈｒｅｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ ｐｅｐｐｅｒ ａｎｔｈｒａｃｎｏｓｅ １．５ ＰＣＲ产物的回收、克隆和测序 ＰＣＲ产物经凝胶回收、纯化后与ｐＭＤ１８Ｔ载体 连接后转化大肠杆菌ＪＭ １０９，经菌落ＰＣＲ鉴定后， 挑选阳性克隆送上海生工公司测序。 ２结果与分析 ２．１基因组ＤＮＡ的提取 从辣椒炭疽病３病原菌株中提取的基因组 ＤＮＡ经琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图１，泳道１、 ３、６条带亮度和清晰度较好，说明提取的ＤＮＡ量、 纯度和完整性较好，适于进一步的研究。 ２．２辣椒炭疽菌３病原核糖体ＤＮＡ ＩＳＴ区的ＰＣＲ 扩增 利用通用引物ＩＳＴ１／ＩＴＳ４对辣椒炭疽病３病原 的ＤＮＡ模板进行ＰＣＲ扩增，由ＰＣＲ产物（图２．） 可以看出，３病原的ｒＤＮＡ。ＩＳＴ片段均为在５００ ｂｐ和 ７５０ ｂｐ之间的一条特异性扩增条带，与预期目的片 段长度基本一致。 ２．３辣椒炭疽病３病原ｒＤＮＡ ＩＳＴ区序列分析 将３病原的序列分别在ＧｅｎＢａｎｋ中注册，序列 号分别为ＥＦ４６８４９６、ＥＦ４８８８１７和ＥＦ５０１９８２。根据 测序结果，用ＤＮＡＭＡＮ软件将分离所得菌株的核糖 体ＤＮＡ ＩＳＴ序列进行比较，结果如图３所示（图中 空格示差异碱基， 示相同碱基），经分析发现，３菌 株核糖体ＤＮＡ ＩＳＴ序列的实际长度分别为５８５，５７４ ５８０ ｂｐ，长度没有明显差异。其中辣椒黑色炭疽菌 与红色炭疽菌菌株在该区域的序列同源性为８８．６２ ％，黑色炭疽与黑点炭疽的序列同源性为９１．３９％， 红色炭疽与黑点炭疽的同源性为８８．１４％；病菌的 ５．８Ｓ ｒＤＮＡ序列高度保守，而ＩＳＴ区的可变性则相 对较高，其中ＩＳＴ１区的差异大于ＩＴＳ２区的差异，说 明３菌株在ＩＳＴ１区的变异较丰富，可考虑将该区域 作为病原鉴定的ＰＣＲ检测特异引物的靶序列。 维普资讯 http://www.cqvip.com
１２３６ 西南农业学报 ２Ｏ卷 ¨ｑ￡ ＴＣＣ盯＾５ Ｔ ＾ＡＣ ＣＴ Ｃ５∞Ｌ５ ５＾ＴＣ＾ＴＴｌ＾￣ＴＧＡＧｍＣＣ ５ＣＴＣ＾ＴＣ＾ＡＣ ＣＣＴＴｒ盯 ＾Ａ ”ｑ， ＴＣＣ盯Ａ￣ＧＴＧ＾＾Ｃ ＣＴ矾５Ｗ ５ ５ＡＴＣＡＴＴＡ ＣｒＷ ｒｒｒＡＣ ＴＣＴ两 两两Ｃ ＣＣＴＴｒ四 ＾＾ ｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔ￡ｔ＾ｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔ ｔｔｔｔｔ ｔ＾＾ｔｔｔ＾ｔ＾＾ｔｔｔ １±０ ｑｌ Ｃ盯＾Ｃ ＣＴ－－＾＾Ｃ Ｃ盯Ｔ ＴｒＣ５５ ＣＢ ＡＧＢ ５＾Ａ５ＣＣＴＣＴＣ＾Ｃ５ ＣＴＣＣＣ ＣＴＣＣＣ ５５ Ｈｑ２ Ｃ＾ＴＡＣ ＣＴＴ－ＡＡＣＴＧＴＴ５ＣＴＴＣ ５Ｃ５ 盯＾５ Ｃ５ＴＣ ＣＣＣＴＡ＾＾＾Ａ５融Ｃ订Ｃ…ＴＣＣＣ ５５ ｊ ｑ ＣＡＴ＾Ｃ ＣＴ＾Ｔ＾＾ＣＴ竹Ｔ ＴＴ ＣＣ５ＣＧ 疆Ａ５Ｇ订ＣＴＣＣ Ｔ……融Ｃ ＣＣＴ…．ＣＣＣ ５５ ｔ ｔｔｔｔｔ ｔｔｔ ｔｔｔｔｔ±ｔｔｔｔｔｔｔｔ ｔｔｔ ｔ ＾ ｔ ｔ 囊＾ｔｔｔ 工 Ｏ ｑｌ Ｃ５Ｃ Ｃ ５ＣＣ ＣＣ Ｃ＾Ｃ Ｃ＾Ｃ５５ ５５＾Ｃ５Ｂ ５Ｃ５ＣＣ ＣＢＣ Ｃ５融 －Ａ＾ＣＣ ＡＣＴＣＴＡＴｒ．强Ｃ＾Ｃ ｑ￡ ＣＣＣＴ・－ＣＴＣＣ Ｃ明 Ｃ－Ｃ５Ｃ ＧＧＧＴＧ Ｃ‘ＣＧＣＣ ＣＣＣ Ｃ５融５驰邛 ＣＣ ＣＴＣＴＧ＾Ｔｍ＾Ｃ ¨ｑ２ ＣＣＴＣ・－ＣＣ ＢＣ ＣＣＣ ＣＢＧＢＣ ＢＢ盯Ｃ 岳－ＣＢＣＣ ＣＣＣ ＣＢ融Ｇ驰ｎ ＣＣ ＣＴＣＴＧ ｍ＾Ｃ ｔ ｔ ＾ｔ ＾ ＾ ｔｔ ｔ±＾ｔ＾ｔｔ＾★＾＾ｔ＾ｔ＾＾ ＾＾＾＾＾ｔ＾ ｔｔ＾ ｔ＾ ｔ＾ 卜ｓ．毒３ ２哇０ ０ｑｌ 强Ｃ汀ＣＴＣＴＴＣＴ岳＾ Ｔ５５ Ｃ＾Ｃ＾ＡＢＣ Ｔ＾觚Ｔ＾Ａ＾ＡＣＴｒＴＴｌ＾＾Ｃ＾ＡＣ岳５＾ＴＣＴＣＴｒ 明 ”ｑ２ 强Ｃ订ＴｒｃＴＴＣＴ ＾６Ｔ融Ｃ＾Ｃ＾Ａ Ｃ Ｔ＾＾ＴＣ＾Ａ＾ＡＣＴｒ ＿Ａ＾Ｃ＾ Ｃ Ｇ ＾ＴＣＴＣＴｒ ５Ｔ ”ｑ ３ 强Ｃ￣ＴＴＴＣＴＴＣＴ ＾５ＴＢ５ｒ＾Ｃ＾Ａ ＴＡＡＴ￡＾Ａ＾ＡＣＴｒＴＴＡＡＣ＾ ５＾ＴＣＴＣＴｒ 盯 囊ｔｔｔｔ ｔ囊囊＾＾ｔｔｔｔ囊ｔ ｔｔ囊囊ｔｌｔｔ＾囊囊ｔｔ ｔｔ＾ｔｔ囊ｔｔｔｔｔ囊囊囊ｔｔｔ＾囊囊囊囊ｔｔｔｔｔ 奎Ｏ ０ ｃｑ１ ＴＣＴ５ ￡ＡＴＣＧＡＴ￣ＡＡ强＾Ｃ５亡＾５ＣＧＡ￣ＴＧＣ Ｔ＾Ａ盯触Ｔ盯融＾ＴＴ Ａ皓＾ＴＴ亡＾盯 ｑ￡ ＴＣＴＢ ＣＡＴＣＧＡＴＢＡＡ ＣＢＣ＾Ｇ ＣＧ Ｔ Ｃ她Ｔ＾＾盯 Ｔ汀融 ＧＣＡ融＾ ＴＣ＾们 ｑ２ ＴＣＴ５ Ｃ＾ＴＣＧＡＴＧ￣． Ｃ５亡＾５Ｃ５ Ｔ５ Ｃ她Ｔ＾＾们 ￣．ＴＧＴ融＾．ｒｒ ＾融＾ＴＴＣ＾们 ｔｔｔ＾＾ｔ＾＾±＾＾ｔ＾＾±ｔｔ＾ｔｔｔ±＾＾＾±ｔｔｔｔ±±ｔｔ＾ｔｔｔ±ｔ＾ｔｔｔｔｔｔ±＾＾ｔｔｔ±ｔｔｔｔｔｔ ２６ ０ ｃｑ１ ＴＣ＾ＴＣ融＾ＴＣＴｒＴ融＾Ｃ ＾Ｃ鱼ＴＴ ＣＧＣＴＣ ＣＡＧＣ＾ＴｒＣＴ５ ６鱼 ＣＡＴ５Ｃ ＣＴ Ｔｒ ０ｑ￡ ＴＣ＾ＴＣ融＾ＴＣＴｒＴ融＾Ｃ ＢＣ＾Ｃ＾ＴＴ Ｃ ＣＣＣ Ｃ＾ＧＣ＾ＴＴＣＴＢ ＧＧ５Ｃ＾Ｔ ＣＴ ＴＴ ¨ｑ２ ＴＣ＾ＴＣ融 ＣＴＴＴ融＾Ｃ ＧＣ＾Ｃ＾ＴＴ Ｃ ＣＣＣ ５Ｃ Ｃ＾ Ｃ＾ＴｒＣＴ５５ＣＢ５ Ｃ＾Ｔ５Ｃ ＣＴＢ＂ＩＴ ｔｔｔｔ＾＾ｔ±ｔｔｔｔｔｔ＾￡ｔ±ｔｔｔ＾＾ｔｔｔｔｔｔ＾＾ 毒ｔ±ｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔ ＾ｔｔｔ＾ｔｔｔｔｔｔ 卜－ＩＴ３２ 壬￡０ ｃｑ１ Ｃ融ＢＣ汀Ｃ＾Ｔ１．ｒＣ＾ＡＣＣＣＴＣ＾Ａ—Ｃ＾ＣＣ５ＣＴＴ５５融ＴｒｒＴ５５Ｂ５ＣＣ ＣＣ＾Ｃ ５ＣＣ强Ｃ订５５ ｃｑ２ Ｃ融５Ｃ汀Ｃ＾ＴＴｒＣ融ＣＣＣＴＣ＾Ａ５ＣＴＣＴ５ＣＴＴ —Ｔ订ＴＧＧＧＧ ＣＴＣＴ＾Ｃ５明 强Ｃ盯＾５ ｊ ｃｑ， Ｃ她ＢＣ订Ｃ＾ＴＴＴＣＡＡＣＣＣＴＣ＾ ５ＣＴＣＴ５ＣＴＴＢ５－一Ｔ们 Ｔ ＧＧ．ＧＣＣ ＣＴＡＣＡＧＣＴ融Ｔ田＾５ ｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔ ｔ囊ｔｔｔｔｔ＾ ｔ ｔ ｔｔｔｔ囊ｔ ｔ ｔ囊ｔ＾ｔｔｔ ｔ ｔｔ ｔ ｔｔ ＾ｔ 囊 ｔ８ ０ ｊ ｃｑｌ Ｃ ＣＴ ＾５Ｂｒ＾盯Ｇ Ｃ ＢＢ＾ＣＣ ＣＴＣＣＣ ＧＡ ＣＴ ＣＣＴＴＴ ＢＴ＾阻ｌＡＡＣ－ＴＡ＾Ｔ盯ＣＴＣ ｊ ｅｑ２ Ｃ ＣＴ Ａ５５ｒ＾盯 Ｃ ５５＾ＣＣ ＣＴＣＴＣ Ａ ＣＴＣＣＴＴｒ ＢＴ＾们．Ａ＾Ｃ ｍＣ盯ＣＴＣ ｑ ＧＣＣ ＣＴＣ＾ Ａ５阻ｌ＾ＣＴＧ Ｃ ５５＾ＣＣ ＣＴＣＣＣ Ｃ＾５Ｃ ＣＴＣＣＴＴＣ Ｃ５ＴＡｍ＾Ｃｒｒｒ＾Ｃ四ＣＴＣ ｔｔ±ｔｔ ｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔ＾±＾＾＾ｔ＾＾± ｔｔｔｔ★＾±ｔｔｔ±＾＾ｔｔｔｔｔｔｔ＾■ ｔ ｔ＾＾ｔｔ 卜－２ ｓ： ｓ哇０ ｃｑ１ ５Ｃ＾￡Ｔ５５ＢＡＴ Ｃ Ｃ５融ＧＧＧＡ￣ＴＣＴＴ ＣＣ５Ｔｒ ＣＣ ＣＣＣ＾ ＣＴＴＴｌＡＣＡ５盯Ｔ ＾ＣＣＴＣ ｃｑ２ ＾ＴＴ５５ＢＡＴＴＣ５强ＧＧＧＡ￣ＴＣＴＡ暑ＣＣ ＴＡ 垴ＣＣ ＣＣＣ＾ Ｔ ＴＡＣＴＡ－点５盯Ｔ ＡｃＣＴＣ ¨ｑ２ ５Ｃ＾ＣＴＧＧＶ， ＣＣ ＧＡＧ ５＾ＣＴＣＴＴ ＣＣＧＴＡ＾＾毛ＣＣ ＣＣＣＡＡＴＴＴＴＣ ＣＡ＾一Ａ５ＧＴＴ ＡＣＣＴＣ 囊囊ｔ ｔｔ＾囊囊ｔ ＾ｔ＾ｔ囊ｔｌ＾＾ｔ＾ｔ ＾囊＾＾ｔ ｔ囊 ｔ＾ｔｔｔｔ囊 ｔｔ ｔ ｔｌ囊ｔｔｔｔ＾≈囊囊 ＳｇＯ ｃｑｌ 岳５＾ＴＣ＾５ＢＴ鱼Ｂ融＾Ｔ占ＣＣ Ｃ岳ＣＴ 弘ＣＴｒ＾ＡＢＣ＾Ｔ＾ＴＣ＾ 弘 Ｃ引皓Ｂ她 ｃｑ￡ Ｇ融ＴＣ＾５ Ｔ＾ 融＾ｌＴＡＣＣ ＣＧＣＴ ＾ ＣＴｒ＾Ａ 鱼Ｔ＾ＴＣＡ＾Ｔ鱼＾ Ｃ 她 ｊ ｃｑ２ ５她ＴＣＡ５ ＴＡ 融ＡＴＡＣＣ Ｃ５ＣＴ５Ａ ＣＴｒ＾Ａ Ｃ鱼Ｔ＾ＴＣＡ＾ＴＡ＾ＢＣ５融Ｂ她 囊ｔｔｔ＾ｔｔ囊ｔｔ＾＾＾ｔｔ囊＾ｔｔｔ＾＾ｔｔｔｔｔｔ＾＾ｔｔｔ±＾ｔｔｔ囊ｔｔｔｔｔｔｔｔｔ囊＾ 图３辣椒炭疽病３病原ＩＴＳ区序列比较 Ｆｉｇ．３ Ｓｅｑｕｅｎｅｅ ｅｏｍｐａｒｉｓｉｏｎ ｏｆ ＩＴＳ ａｍｏｎｇ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｐａｔｈｏｇｅｍ ３讨论 断技术很有帮助，对该病害的预测预报及防治都具 有一定的实际意义。 相对于植物病原菌传统的生物学检测鉴定方 参考文献： 法，以ＰＣＲ为基础的分子检测技术具有特异性强， ［１］巩振辉，王鸣，周新民，等．辣椒炭疽病病原菌及致病力差异 灵敏度高，可重复性强，受外界因素影响较小等特 ［Ｊ］．北方园艺，１９９２（１）：４—６． 点。菌核糖体ＤＮＡ（ｒＤＮＡ）相当保守，但其ＩＴＳ进 ［２］ＪｏｈａｎｓｏｎＡ，ＴｕｍｅｒＨ Ｃ，ＭｃＫａｙ Ｇ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ａ ＰＣＲ－ｂａｓｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈ ｆｕ，ｓｉ ｏｆ ｔｈｅ ｒｉｃｅ ｓｈｅａｔｈ－ｂｌｉｇ｝ｌ￡ｃｏｍｐｌｅｘ，Ｒｈ／ｚｏｃｔｏｎ／ａ ｓｏ／ａ一 化相对较快。在同一属内因菌种不同而出现变异， ，Ｒ．０ ，兄ｏｒｙｚａｅ－ｓａｔ／ｖａｅ［Ｊ］．ＦＥＭＳＭ ｉｃｍｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９８， 种间也存在一定的变异，种内差异较小。由于ｒＤＮＡ １６２（２）：２８９—２９４． 多拷贝，较易于ＰＣＲ扩增，同时包含保守与变异序 ［３］Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ Ｐ，Ｐａｒｒｙ Ｄ Ｗ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｕ８ｅ ｏｆ ａ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｔｏ ｄｅ－ 列，易于根据保守序列中的变异位点设计特异性引 ｔｅｃｔ融 蝴 ｈ，ｔ｜ｌｅ ｃａｕｓｅ ０ｆ ８ｈａＩｐ ｅｙｅ叩０ｔ ｉｎ ｗｈｅａｔ［Ｊ］． 物【６】。杨佩文、肖长坤等分别根据ｒＤＮＡ－ＩＴＳ区域 Ｐ】ａｎｔ Ｐａｌｈ０ｌ０ ，ｌ９９６，４５（５）：８７２—８８３． ［４］方中达著．植病研究方法（第三版）［Ｍ］．北京：中国农业出版社， 的差异建立了大白菜根肿病菌和白菜种传黑斑病菌 ｌ９９８． 的分子检测方法 。 ［５］ｗＨｒｒＥ．ＰｃＲ ｐｍｔｏｃ０ｌ８［Ｍ］．ＡｃａｄｅｔＩＩｉｃ ｐｒ嘲，１９９０． 辣椒炭疽病（ｐｅｐｐｅｒ ａｎｔｈｒａｃｎｏｓｅ）是辣椒生产中 ［６］Ｂｎｌｎ８Ｔ Ｄ，ｗｈｉｔｅ Ｔ Ｊ，Ｔａｙ０ｒ Ｊｗ．Ｆｕｎｇａｌｍ０ｌｅｃｕｌ８ｒｓｙｓｔｅｍ ａｔｉｃ８［Ｊ］． 的主要病害之一，本研究对危害我国辣椒生产的炭 Ａｎｎｕ８ｌ Ｒ ｅｗ ０ｆ Ｅｃ０ｌ０ ａＩＩｄ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ８，ｌ９９ｌ，２２：５２５—５６４． ［７］杨佩文，李家瑞，杨勤忠，等．根肿病菌核糖体基因ｎ 区段的克 疽病菌的核糖体基因ＩＴＳ区域进行了研究，分析了 隆测序及其在检测中的应用［Ｊ］．云南农业大学学报，２０ｏ３，ｌ８ 辣椒黑色炭疽、黑点炭疽和红色炭疽这３种病原的 （３）：２２８一．２３３． ＩＴＳ区的碱基序列，并进行了同源性比较。结果发 ［８］肖长坤，郑建秋，李健强，等．白菜种传黑斑病菌ｒＤＮＡ ｎ 区序 现，ＩＴＳ１区可作为合成ＰＣＲ检测特异性引物的理想 列分析［Ｊ］菌物学报，２ｏ０５，２４（３）：４ｌ４—４２１． 靶序列，该结果对建立辣椒炭疽病菌的分子检测诊 （责任编辑李洁）
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