ＪＯＵＲＮＡＬ 广 西 ＯＦ ＧＵＡＮＧＸＩ医 科 ＭＥＤＩ大 ＣＡＩ学 ＵＮＩ学 ＶＥＲＳＩ报ＲＳＩ ＴＹ ２０１０ Ａｐｒ；２７（２）・ １８８ ・ 短尾蝮蛇毒磷脂结合抗凝蛋白Ｉ３亚基的基因克隆和序列分析 黎渊弘林文珍 臧宁 梁莹。 黎肇炎 △ （广西医科大学第一附属医院药剂科南宁 ５３００２１） 摘要 目的：克隆短尾蝮蛇毒磷脂结合抗凝蛋白（ＰＢＡＰ）ｐ亚基基因，并对该基因进行序列分析。方法：从短尾蝮蛇的毒腺中提 取总ＲＮＡ，设计引物并采用ＲＴ—ＰＣＲ技术进行体外扩增ＰＢＡＰ￣亚基ｃＤＮＡ序列，将ＰＣＲ扩增产物克隆至载体ＰＭＤ－１９Ｔ，通 过ＰＣＲ进行鉴定后，提取阳性克隆菌体质粒进行测序。结果：序列分析结果显示：ＰＢＡＰ￣亚基ｃＤＮＡ序列长度为４４１ ｂｐ，编码 框由１４６个氨基酸组成，其中包括由２３个氨基酸的信号肽，以及１２３个氨基酸组成的成熟肽。结论：ＰＢＡＰ￣亚基基因及其氨 基酸序列和已报道的一些蛇毒凝集素８亚基的基因以及氨基酸序列相比较，有８８ ～９９ 的同源性。 关键词蛇毒；克隆；序列分析 中图分类号：Ｒ９１４．１ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００５—９３０Ｘ（２０１０）０２—０１８８—０４ ＧＥＮＥ ＣＬＯＮＥ ＡＮＤ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＡＮＡＬＹＳＩＳ ＯＦ ＴＨＥ ｐ ＳＵＢＵＮＩＴ ＯＦ ＰＨＯＳＰＨＯＬＩＰＩＩ）．ＢＩＮＤ。 ＩＮＧ ＡＮＴＩＣＯＡＧＵＬＡＴＩＯＮ ＰＲｏＴＥＩＮ ＦＲＯＭ ＡＧＫＩＳＴＲＯＤＯＮ ＨＡＬＹＳ ＢＲＥＶＩＣＡＵＤＵＳ ＶＥＮ— ＯＭ Ｌｉ Ｙｕａｎｈｏｎｇ，Ｌｉｎ Ｗｅｎｚｈｅｎ，Ｚａｎｇ Ｎｉｎｇ，ｅｔ ａ１．（Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｉｒｓｔ Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｇｕａｎｇｘｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｎｉｎｇ ５３００２１ Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｃｌｏｎｅ ａｎｄ ａｎａｌｙｚｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉ ｄ—ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＰＢＡＰ）ｆｒｏｍ Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ ｈａｌｙｓ Ｂｒｅｖｉｃａｕｄｕｓ ｖｅｎｏｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｖｅｎｏｍ ｇｌａｎｄ ｏｆ ｓｎａｋｅ Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ ｈａｌｙｓ Ｂｒｅｖｉｃａｕｄｕｓ．Ｔｈｅ ｃＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｊ３ ｓｕｂｕｎｉｔ ｏｆ ＰＢＡＰ ｗｅｒｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ ＲＴ—ＰＣＲ ｕｓｉｎｇ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｐＭＤ １ ９一Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ．Ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｌｏｎｅｓ ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ｍｅａｎｓ ｏｆ ＰＣＲ ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｃＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｌｏｎｅｓ ｄｉｒｅｃｔｌｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｐ ｓｕｂｕｎｉｔ ｏｆ ＰＢＡＰ ｗｈｉｃｈ ｅｎｃｏｄｅｄ ａｎ ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ（ＯＲＦ）ｏｆ １４６ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｗａｓ ４４１ ｂｐ，ａｌｓｏ ｉｎｃｌｕｄｅｄ ａ ｓｉｇｎａ１ ｐｅｐｔｉｄｅ ｏｆ ２３ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ，ｍａｔｕｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ １２３ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅ Ｇ ｓｕｂｕｎｉｔ ｏｆ ＰＢＡＰ ｗａｓ ｃｏｍ－ ｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｆｏｒ ｏｔｈｅｒ Ｌｅｃｔｉｎ ｏｆ ｓｎａｋｅ ｖｅｎｏｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｕｂｕｎｉｔ（ｓｕｃｈ ａｓ Ｄｅｉｎａｇｋｉｓ～ ｔｒｏｄｏｎ ａｃｕｔｕｓ，Ｔｒｉｍｅｒｅｓｕｒｕｓ ｓｔｅｊｎｅｇｅｒｉ），ｔｈｅｉｒ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｗａｓ ８８ ～９９ ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ ｓｎａｋｅ ｖｅｎｏｍ；ｃｌｏｎｉｎｇ；ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ 我们从短尾蝮蛇毒中分离纯化出磷脂结合抗凝蛋白 研究。本实验从浙江短尾蝮蛇的毒腺中提取总ＲＮＡ，克隆 （Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ—ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｔｉ０ｎ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＰＢＡＰ），并对 磷脂结合抗凝蛋白８亚基基因，并对该基因进行序列分析， 其生化性质＿Ｊ］、药理作用Ｌ２ 及抗凝机理 ］进行了相关研究， 现报道如下。 发现该蛋白不仅能有效抑制凝血因子Ⅸ的活性，对凝血因子 Ⅷ、Ⅺ、Ⅻ因子的活性都有不同程度的抑制，它没有出血和溶 １材料与方法 血反应，是一种新型的抗凝蛋白。由于自然界中蛇资源非常 １．１材料：浙江短尾蝮蛇购自浙江省衢州万田蛇类养殖场。 有限，因此我们考虑通过分子生物学的克隆、表达等方法来 焦碳酸二乙酯（ＤＥＰＣ）、细菌培养用胰化蛋白胨、细菌培养用 得到大量的磷脂结合抗凝蛋白，以方便对该蛋白进行更多的 酵母提取物为Ｓｉｇｍａ公司产品；总ＲＮＡ抽提试剂盒购自上 海华舜生物工程有限公司；ＲＴ—ＰＣＲ反应试剂盒、感受态受体 ＊基金项目：广西研究生教育创新计划项目资助 菌ＪＭ１０９、耐热ＤＮＡ聚合酶（Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、ＤＮＡ （Ｎｏ．２００６１Ｏ５９８１００７Ｄ１０） 限制性内切酶、载体ＰＭＤ－１９Ｔ、Ｘ－Ｇａｌ、ＩＰＴＧ、氨苄青霉素均 １广西医科大学生物化学与分子生物学教研室 购自大连宝生物工程有限公司，其它试剂均为国产分析纯试 ２广西医科大学医学科学实验中心 剂。 ３广西医科大学微生物学与免疫学教研室 １．２方法 △通信作者：Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｙｌｉ２００１＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｒｎ １．２．１总ＲＮＡ的提取：将蝮蛇断头后，立即取出毒腺，按照 收稿日期：２００９—０２—１５ 总ＲＮＡ抽提试剂盒推荐的方法进行。 黎渊弘，等．短尾蝮蛇毒磷脂结合抗凝蛋白Ｂ亚基的基因克隆和序列分析 ・ １８９ ・ １．２．２引物的合成：参考竹叶青凝血因子Ⅸ结合蛋白核苷 酸保守的５端和３端非翻译区的保守序列 设计一对上游 引物和下游引物（浓度为２５０￣ｍｏｌ／Ｉ ），由宝生物工程有限公 司（大连）合成，序列如下：正向引物：５ ｇｇａｃｇｇａａｇｇａａｇａｃ— ｃａｔｇ一３ ；反向引物：５ ｇｇｃａｇａａｔｔｔａｔｔｇｇａｃｃｔｔｃ一３ 。 １．２．３ ｃＤＮＡ的获得 １．２．３．１ 首先按照下列反应体系进行反转录：模板总ＲＮＡ １ Ｌ；ＭｇＣ１２（２５ ｍｍｏｌ／Ｌ）２ Ｌ；１０ Ｘ ＲＴ缓冲液１ Ｌ；ＲＮＡ 酶抑制剂（４０ Ｕ／ｕＬ）０．２５ Ｌ；无ＲＮＡ酶双蒸水３．７５ Ｉ ； ＡＭＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎ—Ｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＸＩ （５Ｕ／ｇ１）０．５“Ｌ；反向引物 （２５０￣ｍｏｌ／Ｉ ）０．５”Ｉ ；ｄＮＴＰ（１０ ｍｍｏｌ／Ｉ ）１”Ｌ；总量为 １Ｏ Ｉ ；按下列条件进行反应：４２℃３０ ｍｉｎ；９９℃５ ｍｉｎ；５℃ ５ ｍｉｎ；共一个循环。 １．２．３．２将以上反应所得产物作为模板，按照下列条件进 行下一步反应：模板１０ Ｉ ；５ Ｘ ＰＣＲ缓冲液１０ Ｉ ；正向引 物Ｐ１ ０．５ Ｉ ；无ＲＮＡ酶双蒸水２９．２５ Ｌ；ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ 酶０．２５ Ｉ ；总量为５Ｏ Ｉ 。反应条件：９４℃５ ｍｉｎ；９４℃ ３０ Ｓ；５１℃３Ｏ Ｓ；７２℃１ ｍｉｎ，共进行３Ｏ个循环。反应结束后 取１Ｏ Ｉ 反应产物进行１ 琼脂糖凝胶电泳鉴定，溴化乙锭 染色后，ＰＣＲ产物约为４００ ｂｐ。 １．２．４ 目的ＤＮＡ重组克隆：参照文献［７，８］及试剂盒推荐 的方法将ＰＣＲ产物与ＰＭＤ１９－Ｔ载体于１６℃连接，转化至 Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９感受态细胞中，培养于含有Ｘ Ｇａｌ、ＩＰＴＧ、氨苄 青霉素（１０ ｍｇ／Ｉ ）的Ｉ Ｂ琼脂培养基上，３７℃培养过夜后，挑 取白色菌落进行ＰＣＲ鉴定，选取阳性克隆菌体。 １．２．５ ＤＮＡ序列测定和分析：阳性克隆菌体由大连宝生物 工程有限公司进行序列测定验证，采用ＶｅｃｔｏｒＮ『ＴＩ ｓｕｉｔｅ ７．０ 软件进行序列比较分析。 ２ 结 果 ２．１ 蛇毒总ＲＮＡ的提取：按照试剂盒推荐的方法抽提及纯 化蛇毒总ＲＮＡ，紫外分光仪检测Ａ ／Ａ 。一一１．８，Ａｚ。 ／ Ａ２ 一２．２，计算出浓度约为４．２ ｇ／Ｉ ；ＲＮＡ电泳可见２８Ｓ 及ｌ８Ｓ两条带（图１）。以上结果表明ＲＮＡ的质量和浓度符 合反转录的要求。 ２．２ ＰＣＲ结果：按照试剂盒推荐的方法对短尾蝮蛇毒总 ＲＮＡ进行ＲＴ—ＰＣＲ扩增。１ 琼脂糖凝胶电泳分析ＰＣＲ产 物，引物的扩增产物在大约４００ ｂｐ处可见有一特异的ＤＮＡ 条带（图２）。 ２．３ ＤＮＡ的连接反应、克隆、大肠杆菌的转化：参照文献［７， ８］及试剂盒推荐的方法将ＰＣＲ纯化产物克隆到ｐＭＤ １９－Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ载体，转化大肠杆菌ＪＭ１０９，接种于含有Ｘ－Ｇａｌ、 ＩＰＴＧ、氨苄青霉素（１０ ｍｇ／Ｉ ）的Ｉ Ｂ平板上，培养后产生蓝、 白两种菌落。 ２．４ 阳性克隆质粒的抽提和鉴定：挑取白色菌落抽提质粒， 通过ＰＣＲ反应鉴定重组子。ＰＣＲ扩增后产物进行琼脂糖凝 胶电泳分析，均见大约４００ ｂｐ的ＤＮＡ条带。 ２．５ ｃＤＮＡ序列分析：根据测序的结果获得的ＰＢＡＰ￣亚基 ｃＤＮＡ序列，利用ＮＣＢＩ数据库中的ＯＲＦ ｆｉｎｄｅｒ推导它的氨 基酸序列（图３），序列分析结果显示：编码框有４４１ ｂｐ，编码 由１４６个氨基酸组成的ＰＢＡＰＩ￣亚基。其Ｎ端由１～２３个氨 基酸组成信号肽（划线处），由２４～１４６个氨基酸构成ＰＢＡＰ￣ 亚基的成熟肽。 ２８ Ｓ １８ Ｓ 图１总ＲＮＡ琼脂糖凝胶电泳 ２ ０００ ｂｐ １ ０００ ｂｐ ７５０ ｂｐ ５００ ｂｐ ４００ ｂｐ ２５０ ｂｐ ｉ００ ｂｐ ｈｌ Ｉ 图２ ＰＣＲ产物琼脂糖凝胶电泳图 Ｍ：ＤＩ ２０００ ｍａｒｋｅｒ Ｉ：ＰＣＲ扩增产物 １ ａｔｇｇｇｇｃｇａｔｔｃａｔｃｔｔｃｇｔｇａｇｃｔｔｃｇｇｃｔｔｇｃｔｇｇｔｃｇｔｇｔｔｃ ｌ Ｍ Ｇ Ｒ Ｆ Ｉ Ｆ Ｖ Ｓ Ｆ Ｇ Ｌ己、，Ｖ Ｆ ４６ ｃｔｃｔｃｃｃｔｇａｇｔｇｇａａｃｔｇｃａｇｃｔｇａｔｔｇｔｃｃｃｔｃｔｇｇｔｔｇｇｔｃｃ １６ Ｌ Ｓ Ｌ Ｓ Ｇ Ｔ Ａ Ａ Ｄ Ｃ Ｐ Ｓ Ｇ Ｗ Ｓ ９１ ｔｃｔｔａｔｇａａｇｇｇｃａｔｔｇｃｔａｃｃａｇｃｃｃｔｔｃａａｔｇａａｃｃａａａａａａｃ ３ｌ Ｓ Ｙ Ｅ Ｇ Ｈ Ｃ Ｙ Ｑ Ｐ Ｆ Ｎ Ｅ Ｐ Ｋ Ｎ １ ３６ ｔｇｇｇｃｃｇａｔｇｃａｇａｇａａｔｔｔｃｔｇｃａｃａｃａａｃａｇｃａｃａｃａｇｇｃｇｇａ ４６ Ｗ Ａ Ｄ Ａ Ｅ Ｎ Ｆ Ｃ Ｔ Ｑ Ｑ Ｈ Ｔ Ｇ Ｇ １８１ ｃａｔｃｔｇｇｔｃｔｃｃｔｔｃｃａｃａｇｃａｃｔｇａａｇａａｇｃａｇａｔｔｔｔｇｔｇｇｔｃ ６ｌ Ｈ Ｌ Ｖ Ｓ Ｆ Ｈ Ｓ Ｔ Ｅ Ｅ Ａ Ｄ Ｆ Ｖ Ｖ ２２６ ａａｇｃｔｇｇｃｃｔｔｃｃａａａａｔｔｔｔｇｇｃｃａｃｇｇｃａｔｔｔｔｃｔｇｇａｔｇｇｇａ ７６ Ｋ Ｌ Ａ Ｆ Ｑ Ｎ Ｆ Ｇ Ｈ Ｇ Ｉ Ｆ Ｗ Ｍ Ｇ ２７１ ｃｔｇａｇｃａａｔｇｔｃｔｇｇａａｔｃａａｔｇｃａａｔｔｇｇｃａａｔｇｇａｇｃａａｔｇｅｔ ９ｌ Ｌ Ｓ Ｎ Ｖ Ｗ Ｎ Ｑ Ｃ Ｎ Ｗ Ｑ Ｗ Ｓ Ｎ Ａ ３ １６ ｇｃｃａａｇｃｔｃａａａｔａｃｇａａｇｃｃｔｇｇｇｃｔｇａａｇａａｔｃｔｔａｔｔｇｔｇｔｃ １０６ Ａ Ｋ Ｌ Ｋ Ｙ Ｅ Ａ Ｗ Ａ Ｅ Ｅ Ｓ Ｙ Ｃ Ｖ ３６１ ｔａｒｔｔｃａａｇｔｃａａｃｔａａｔａａｃａａａｔｇｇａｇｇａｇｔａｇａｇｃｃｔｇｃａｇａ １２１ Ｙ Ｆ Ｋ Ｓ Ｔ Ｎ Ｎ Ｋ Ｗ Ｒ Ｓ Ｒ Ａ Ｃ Ｒ ４０６ ａｔｇｇａｇｇｃａｔａｔｔｔｃｇｔｃｔｇｃｇａｇｔｔｔｃａｇｇｃａｔａｇ ４４１ ｌ３６ Ｍ Ｅ Ａ Ｙ Ｆ Ｖ Ｃ Ｅ Ｆ Ｏ Ａ １４６ 图３ ＰＢＡＰｆ］亚基的ｃＤＮＡ序列及推导的氨基酸序列 ・ １９０ ・ 广西医科大学学报２０１０ Ａｐｒ；２７（２） ２．６ ＰＢＡＰ与其他蛇毒蛋白质的同源性分析：利用Ｇｅｎｅ— 合蛋白ｐ链一２、五步蛇抗凝蛋白口链、竹叶青凝血因子ＩＸ／Ｘ Ｂａｎｋ的蛋白质同源性分析软件对ＰＢＡＰ分析得知（见图４）， 结合蛋白ｐ链一１、Ｇｌｏｙｄｉｕｓ蝮蛇凝血因子Ｉｘ＿结合蛋白Ｂ链相 分别与ｈａｌｙｘｉｎ—Ｇｌｏｙｄｉｕｓ蝮蛇８链前体、凝血因子ＩＸ／Ｘ结合 比较，同源性分别为９５ 、８９％、８９ 、９Ｏ 、８８ 、８８％、 蛋白ｐ链前体、五步蛇抗凝血因子（１／２）ｐ一链、Ｇｌｏｙｄｉｕｓ短尾 ８８ 、９９％。 蝮蛇纤维蛋白原凝固抑制剂Ｂ链、竹叶青凝血因子］ｘ／ｘ结 五步蛇抗凝血因子８链 （１）ＭＧＲＦＩＦＶＳＦＧＬＬＷＦＬＳＬＳＧＴＧＡＤＣＰＳＤ ＹＥＧＩＩＣ ＰＦ ——————五步蛇抗凝蛋白Ｂ链 （１）ＭＧＲＦＩＦＶＳＦＧＬＬＶＬＦＬＳＬＳＧＴＡＡＩ）ＣＰＳ——————ＤＷＳＳＹＥＧＨＣＹ基ＰＦ§逆 凝血因子ＩＸ／Ｘ结合蛋白８链前体 （Ｉ）ＭＧＲＦＩＦＭＳＦＧＦＬＷＦＬＳＬＳＧＴＡＡＤＣＰＳＤＷＳＳＹＥＧＨＣ ——————竹叶青凝血因子Ｉ】（／ｘ结合蛋白８链一１ （Ｉ）ＭＧＲＦＩＦＶＳＦＧＬＬＷＦＬＳＬＳＧＴＡＡＩ）ＣＬＳ——————ＧＷＳＳＹＥＧＨＣＹ Ｆ盟 竹叶青凝血因子Ｉ】【／Ｘ结合蛋白８链一２ （１）ＭＧＲＦＩＦＶＳＦＧＬＬＷＦＬＳＬＳＧＴＡＡＤＣＬＳＧＷＳＳＹＥＧＨＣ ——————短尾蝮蛇纤维蛋白原凝固抑制剂８链 （１）ＭＧＲＦＩＦＶＳＦＧＬＬＶＶＦＬＳＬＳＧＴＡＡＤＣＬＳ—————Ｇ—ＷＳＳＹＥＧＨＣＹＫＰＦ Ｅ Ｈａｌｙｘｉｎ－ｇｌｏｙｄｉｕｓ蝮蛇Ｂ链前体 （１）ＭＧＲＦＩＦＬＳＦＧＬＬＶＶＦＬＳＬＳＧＴＧＡＤＣＰＳＧＷＳＳＹＥＧＨＣＹ———————ＫＰＦ！ ｇ 短尾蝮蛇磷脂结合抗凝蛋白 （１）ＭＧＲＦＩＦＶＳＦＧＬＬＷＦＬＳＬＳＧＴＡＡＤＣＰＳＧＷＳＳＹＥＧＨＣＹＮＥＰ ———————ＱＰＦ——五步蛇抗凝血因子８链 （４ ＫＮＷＡＤＡＥＮＦＣＴＱＱＨＴＧＧＨＬ ——五步蛇抗凝蛋白８链 （４４）ＫＮＷＡＤＡＥＮＦＣＴＱ（￣ＨＴＧＳ＿ＨＬ ＴＥＥＡＤＦＶＶＫＬＡＦ‘［［Ｆ巡Ｉ 凝血因子ＩＸ／Ｘ结合蛋白８链前体 （４４）ＫＮＷＡＤＡＥＮＦｃＴＱｑ ＬｖＳ飑 ＤＦ、ｒｖＫＩ＾Ｆ 竖Ｉ 竹叶青凝血因子ＩＸ／Ｘ结合蛋白Ｂ链一１ 竹叶青凝血因子Ｉ）【／ｘ结合蛋白８链一２ 短尾蝮蛇纤维蛋白原凝固抑制剂Ｂ链 （４４） ＥＮＦＣＴＱＱＱ＾ＧＧｍ『ｖＳ Ｉ Ｈａｌｙｘｉｎ－ｇｌｏｙｄｉｕｓ蝮蛇Ｂ链前体 （４４） ｒ ＥＮＦＣＴＱＱＨＴＧＧｍ Ｓ Ｉ 短尾蝮蛇磷脂结合抗凝蛋白 （４４）ｌ（Ｎ 脚ｃＴＱＱｌ｛ＴＧＧＩ｛ＬＶＳ Ｉ 五步蛇抗凝血因子８链 （８７） 五步蛇抗凝蛋白８链 （８７） 竹叶青凝血因子ＩＸ／ｘ结合蛋白Ｂ链一ｌ （８７） 竹叶青凝血因子ＩＸ／Ｘ结合蛋白Ｂ链一２ （８７） 短尾蝮蛇纤维蛋白原凝固抑制剂Ｂ链 （８７） Ｈａｌｙｘｉｎ—ｇｌｏｙｄｉｕｓ蝮蛇Ｂ链前体 （８７） 短尾蝮蛇磷脂结合抗凝蛋白 （８７） 五步蛇抗凝血因子Ｂ链 （１２３）ＫＳＴＮＮＫＷＲＳＩＴＣＲＭＩＡＮＦＶＣＥＦＣＡ ————五步蛇抗凝蛋白Ｂ链 （１２３）ＫＳＴＮＮＫＷＲＳＩＴＣＲＭＩＡＮＦＶＣＥＦＣＡ ————凝血因子ＩＸ／Ｘ结合蛋白８链前体 （１２３） ＣＥＦｃＡ 竹叶青凝血因子Ｉｘ／Ｘ结合蛋白Ｂ链一ｌ （１２３） ｃＥＦ一一 竹叶青凝血因子Ｉ）【／Ｘ结合蛋白８链一２ （１２３） ＣＥＦ一一 短尾蝮蛇纤维蛋白原凝固抑制剂Ｇ链 （１２３） Ｈａｌｙｘｉｎ－ｇｌｏｙｄｉｕｓ蝮蛇Ｂ链前体 （１２３）ｌ（ＳＴＮＮＫＷＲＳＲＡｃＲ髓ＡＹＦ１，ＣＥＦｃＡ 短尾蝮蛇磷脂结合抗凝蛋白 （１２３）ＫＳＴ ＲＳＲＡＣＲＩ旺认ＹＮＦｖｃＥＦＣＡ 图４ ＰＢＡＰＩ３亚基与己知蛇毒蛋白质Ｂ亚基的氨基酸序列比较（不相同的氨基酸残基是用下划线表示） ３ 讨 论 ｂｏ—ｈｙｄｒａｔｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ，ＣＲＤ），蛇毒凝集素的糖结构 活性依赖于钙离子的存在，属于Ⅶ类动物凝集素家族［６３。从 蛇毒含有许多影响血液凝固和纤维蛋白溶解系统的蛋 已报道的各类蛇所含蛇毒中分离到的凝集素样蛋白的氨基 白。这些蛋白分两类：蛋白酶和非蛋白酶。前者通过酶学反 酸序列同源性大致在３Ｏ ～９Ｏ 。虽然其结构非常相似，但 应，激活或灭活几乎所有与止血和纤维蛋白溶解系统的相关 生物活性和作用机制各不相同。一些蛇毒凝集素样蛋白通过 成分。后者通过非共价蛋白——蛋白相互作用，干扰某些凝 结合凝血因子Ⅸ或Ｘ起到抗凝作用，如从黄绿烙铁头（Ｔｒｉ— 血因子，调节血液凝固系统。最近，蛇毒非蛋白酶，主要是Ｃ一 ｍｅｒｅｓｕｒｕｓ ｆｌａｖｏｖｉｒｉｄｉｓ）蛇毒中分离得到的Ⅸ／ｘ．结合蛋白。 型凝集素样蛋白引起了人们的广泛关注。大多数蛇毒ｃ－型 而从美洲矛头蝮（Ｂｏｔｈｒｏｐｓ ｊａｒａｒａｃａ）蛇毒中得到的ｂｏｔｈｒａ— 凝集素样蛋白是由ａ和Ｂ亚单位构成的异构二聚体，两个亚 ｊａｒａｃｉｎ则是一个凝血酶抑制剂。一些蛇毒凝集素样蛋白通 单位在结构上相似，每一亚单位都含有一个糖识别区域（Ｃａｒ— 过作用于ｙｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子或ＧＰＩｂ－Ⅸ一Ｖ、ＧＰＶＩ等血小板 黎渊弘，等．短尾蝮蛇毒磷脂结合抗凝蛋白８亚基的基因克隆和序列分析 受体而引起血小板聚集，如ｂｏｔｒｏｃｅｔｉｎ、ｃｏｎｖｕｌｘｉｎ和ｒｈｏｄｏｃｙｔ— ２００８，２４（３）：４２Ｏ一４２１． ｉｎ。但ｆｌａｖｏｃｅｔｉｎ－－Ａ和ｅｃｈｉｃｅｔｉｎ等蛋白却是通过与ＧＰＩｂ一 黎渊弘，黎肇炎，黄丙轮，等．短尾蝮蛇毒磷脂结合抗凝 Ⅸ一Ｖ的结合而阻断其与ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子的结合而抑制 蛋白对动物血栓的抗栓作用［Ｊ］．中国生化药物杂志， 血小板聚集 ］。本文所克隆的ＰＢＡＰｆｔ亚基基因的氨基酸序 ２００７，２８（１）：３４－３６． 列与已报道的多种蛇所含蛇毒的凝集素样蛋白Ｂ亚基氨基 黎渊弘，钟小斌，龙奕霄，等．短尾蝮蛇毒磷脂结合抗凝 酸序列在结构上非常相似，都含有一个糖识别区域（ＣＲＤ）， 蛋白对家兔血液流变学的影响［Ｊ］．中国生化药物杂 分别于２５、３６、５３、９８、ｌ１９、１３５、１４２和１４５位点均含有半胱氨 志，２００８，２９（１）：４６—４８． 酸残基，与其它蛇毒凝集素样蛋白（图４）的同源性分别为 黎渊弘，黎肇炎，林发全，等．短尾蝮蛇毒磷脂结合抗凝 ８８ ～９９ 。然而，我们所纯化的ＰＢＡＰ与这些蛇毒凝集素 蛋白的抗凝作用及其机理研究［Ｊ］．广西医科大学学报， 样蛋白却有许多不同之处，表现在：（１）磷脂结合抗凝蛋白是 ２００７，２４（２）：２５４—２５６． 蛋白酶，它具有精氨酸脂酶活性，对血小板聚集没有作用；二 Ｌｅｅ Ｗｅｎｈｕｉ，Ｚｈｕａｎｇ Ｑｉｎｇｙｉｎｇ，Ｚｈａｎｇ Ｙｕｎ．Ｃｌｏｎｉｎｇ 价阳离子Ｃａ”，Ｍｇ ，Ｈｇ ，Ｃｏ ，Ｃｕ。 及ＥＤＴＡ对酶活性 ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｂｌｏｏｄ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒⅨ一 没有影响（ＢＡＥＥ法）＿】 ；（２）它不仅抑制凝血因子Ⅸ的活性， ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｖｅｎｏｍ ｏｆ Ｔｒｉｍｅｒｅｓｕｒｕｓ ｓｔｅｊ— 对凝血因子Ⅷ、Ⅺ、Ⅻ因子的活性都有不同程度的抑制¨２］； ｎｅｇｅｒｉ［Ｊ］．Ｔｏｘｉｃｏｎ，２００３，４１（２）：７６５－７７２． （３）抗凝作用的机理可能是直接与磷脂结合，阻止了磷脂类 ］ ］ ］ ］ ］ 彭秀玲，］ 袁汉英，］ 谢毅，等．基因工程实验技术［Ｍ］．第 物质参与凝血过程的作用有关 ］。 ２版．长沙：湖南科技出版社，１９９７：１０７—１２１． 参考文献： Ｊ．萨姆布鲁克，Ｅ．Ｆ．弗里奇，Ｔ．曼尼阿蒂斯．分子克 隆实验指南［Ｍ］．第２版．北京：科学出版社，１９９６：１— －１１］黎渊弘，黎肇炎，林发全，等．短尾蝮蛇毒中磷脂结合抗 ４５０． 凝蛋白的分离纯化及鉴定［Ｊ］．中国药理学通报，２００６， 魏勤，李瑞，王婉瑜，等．四个烙铁头蛇毒凝集样蛋 ２２（７）：２５７－２６１． 白基因的克隆与序列分析［Ｊ］．动物学研究，２００２，２３ ［２］黎渊弘，黎肇炎，林发全，等．短尾蝮蛇毒磷脂结合抗凝 （４）：２７３—２７９． 蛋白体内外对凝血因子的影响［Ｊ］．中国药理学通报， 广西医科大学学报２０１０ Ａｐｒ；２７（２） 蛤蚧乙醇提取液影响去势大鼠胫骨ＴＧＦ—ｌ３ 表达的研究 张胜昌 白 鹭 蓝玲 王 薇 关明明 （广西医科大学人体解剖学教研室 南宁 ５３００２１） 摘要 目的：研究在灌服蛤蚧乙醇提取液去势大鼠胫骨中ＴＧＦ－￣ 的表达，探讨蛤蚧乙醇提取液防治绝经后骨质疏松症的机 理。方法：采用１２月龄ＳＤ雌性大鼠６Ｏ只，随机分为对照组、去势组和实验组。去势组和实验组均切除双侧卵巢，实验组给予 蛤蚧乙醇提取液灌胃处理；对照组给予假手术处理。３组大鼠分别于术后４、１２周，随机各取１Ｏ只，测定骨密度（ＢＭＤ）后处 死，取右侧胫骨，脱钙后包埋切片，ＨＥ染色，计数破骨样细胞；常规ＳＡＢＣ法进行免疫组化染色，图像分析灰度值。结果：实验 组的全身ＢＭＤ明显高于去势组，但仍然低于对照组；实验组的破骨样细胞计数与对照组相似，与去势组比较差异有统计学意 义（Ｐ＜Ｏ．０５）。ＴＧＦ—Ｂ。在实验组及对照组的成骨细胞中呈阳性染色，部分骨基质中也有阳性表达，去势组呈阴性表达。结 论：蛤蚧乙醇提取液可能诱导骨微环境中ＴＧＦ一８】表达增加，进而抑制破骨样细胞的生成，有效地预防绝经后骨质疏松的发生。 关键词 绝经后骨质疏松；蛤蚧乙醇提取液；ＴＧＦ－１３ 中图分类号：Ｒ６８３．４２ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００５—９３０Ｘ（２０ｉ０）０２一Ｏｌ９ｉ－０４ ＴＨＥ ＥＦＦＥＣＴ ｏＦ ＧＥＫＫＯ ＧＥＣＫＯ ＥＴＨＡＮｏＬ—ＥＸＴＲＡＣＴＳ ｏＮ ＴＨＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＯＦ ＴＧＦ－￣Ｉ ＩＮ ＴＨＥ ＴＩＢＩＡ ｏＦ ｏＶＡＲＩＥＣＴＯＭＩＺＥＤ ＲＡＴＳ Ｚｈａｎｇ Ｓｈｅｎｇｃｈａｎｇ，Ｂａｉ Ｌｕ，Ｌａｎ Ｌｉｎ，ｅｔ ａ１． ＊基金项目：广西教育厅科研项目（Ｎｏ．２００８１０ＬＸ３３９），右江民族 （Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｎａｔｏｍｙ， Ｇｕａｎｇｘｉ Ｍｅｄｉｃａｌ 医学院院级课题（Ｎｏ．右科０８０２００４） Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｎｉｎｇ ５３００２１ Ｃｈｉｎａ） 收稿日期：２００９—１１—２５ Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＴＧＦ一