动物营养学报２０１０，２２（３）：６１１－６１５ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ 荧光光度法在瘤胃原虫对细菌吞噬作用研究中的应用 王欢莉 王洪荣卜 刘 翔 宋荣渊 王剑飞 姜小波 （１．扬州大学动物科学与技术学院，扬州２２５００９；２．江苏省盐城中学，盐城２２４００１） 摘 要：本试验旨在探讨荧光光度法研究瘤胃原虫对细菌吞噬作用的可行性。试验选用４只装有永久性瘤胃瘘管 的徐淮山羊采集瘤胃液以获取瘤胃原虫和细菌，以４，６一二脒基一２一苯基吲哚（ＤＡＰＩ）标记细菌的荧光强度为主 要测定指标，研究山羊瘤胃中原虫对细菌的吞噬作用。结果表明，ＤＡＰＩ标记的瘤胃细菌浓度与其荧光强度之间存 在线性相关（Ｒ ＝０．９９５ ２）。在日粮粗精比为７：３的条件下，徐淮山羊瘤胃原虫对细菌的吞噬速率为 ３７０．８９ ｃｅｌｌｓ／（ｃｅｌｌ・ｈ），瘤胃内原虫对细菌的吞噬速率存在一定的波动性，吞噬量在６０ ｍｉｎ达到饱和，其最大吞噬 量为３７０．８９ ｃｅｌｌｓ／ｃｅｌｌ。结果提示，荧光光度法可应用于瘤胃原虫对细菌吞噬作用的研究。 关键词：荧光光度法；瘤胃原虫；吞噬率 中图分类号：￥８２７ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００６．２６７Ｘ（２０１０）Ｏ３—０６１１－０５ 目前，国际上对瘤胃微生物在瘤胃营养物质代 蛋白循环的研究，并可监控相关营养调控的有效性。 本试验所选用的研究瘤胃原虫对细菌的吞噬作用的 方法，不受吞噬时间的限制，并可避免荧光计数法所 产生的人为误差。此法的应用将促进微生物氮循环 的相关研究。 谢中的相互关系研究较少。由于瘤胃内原虫对细菌 的吞噬及原虫的自溶而导致的瘤胃内能量的浪费和 含氮物质的无效再循环 ］，使得瘤胃微生物蛋白对 十二指肠吸收氮的贡献率下降，从而增加宿主动物 对蛋白质的维持需要口。］，因此对瘤胃内微生物蛋白 （ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｒｕｄｅ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＭＣＰ）无效循环的研究 显得尤为重要。其中，原虫对细菌吞噬率的测定方 法是微生物氮循环研究的关键环节。 瘤胃微生物蛋白循环研究的方法主要有：选择 １材料与方法 １．１ 试验材料 ４，６～二脒基一２一苯基吲哚（ＤＡＰＩ）购于Ｓｉｇ． ｍａ公司。 性抑制法、同位素法、荧光标记法和稀释法等＿４。 。 其中报道较多的为荧光标记计数法，即荧光标记细 菌（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｌａｂｅｌｅｄ ｂａｃｔｅｒｉａ，ＦＬＢ），显微计 数，该法能够同时对原虫吞噬种类进行鉴定，进一步 １．２试验动物 选用４只健康、体重（２１．５±１．２）ｋｇ装有永久 性瘤胃瘘管的徐淮山羊，喂以粗（羊草）：精（玉米一 豆粕）比为７：３的１３粮，每１３ ０８：００和２０：００ ２次 进行瘤胃原虫分种属测定吞噬率。但不足是：简易 的装片不能久藏，必须在装片后迅速观察，且标本片 易因为水分蒸发发生结晶，破坏虫体细胞，从而影响 计数的准确性ｌ７］。同时研究发现随着吞噬时间的延 等量饲喂，自由饮水，预试期７ ｄ。预试期后于饲喂 后８ ｈ采集每只山羊瘤胃液各１００ ｍＬ混匀。 １．３试验方法 １．３．１瘤胃细菌与原虫的分离 长，细菌在原虫体内消化使其形态变模糊，使用荧光 显微镜进行镜检时则无法准确计数，又由于吞噬时 问长，荧光标记细菌在原虫体内不断增多，细菌产生 将采集到的瘤胃液参考Ｗａｎｇ 的方法对瘤胃 细菌与原虫进行分离：１）采集瘤胃液，４层纱布过 滤，取一部分样品离心（２９ ０００×ｇ，２０ ｍｉｎ），收集上 堆积现象，这样就无法对原虫体内的荧光标记细菌 准确计数 。因此，有必要建立新的研究方法准确 测定瘤胃原虫对细菌的吞噬，从而促进瘤胃微生物 收稿日期：２００９—１０ １７ 清液，制备无菌瘤胃液，４℃保存。２）其他样品用于 分离细菌与原虫，离心（１５０×ｇ，１０ ｍｉｎ）后，收集原 虫沉淀，并用磷酸盐缓冲液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａ． 基金项目：国家自然科学基金项目（２００８￣２０１０）《日粮含氮物质在瘤胃原虫和细菌之间周转规律和机制的研究》（编号：３０７７１５６７） 作者简介：王欢莉（１９７８一），女，江苏泰兴人，讲师，博士研究生，主要从事反刍动物营养代谢与调控研究。Ｅ．ｍａｉｌ：ａｊｘｂ２０００＠１６３．ｃｏｍ ＊通讯作者：王洪荣，教授，博士生导师，Ｅ—ｍａｉｌ：ｈｒｗａｎｇ＠ｙｚｕ．ｅｄｕ．ｃｎ ６１２ 动物营养学报 ｌｉｎｅ，ＰＢＳ，ｐＨ ７．５）洗涤２次，以无菌瘤胃液悬浸成 ２倍浓度的原虫液。３）取以上低速离心的上清液， 经２ ｔ－ｔｍ滤膜过滤后，离心（２２ ０００×ｇ，１５ ｍｉｎ），沉 淀以ＰＢＳ（ｐＨ ７．０）洗涤２次，离心后以ＰＢＳ（ｐＨ ７．０）悬浸。 １．３．２ ＤＡＰＩ荧光标记瘤胃细菌 将ＤＡＰＩ加入细菌悬液染色，３７℃水浴 ２０ ｍｉｎ，离心（２２ ０００×ｇ，１５ ｍｉｎ），沉淀用甲醇洗涤 １次，ＰＢＳ（ｐＨ ７．０）洗涤２次，以无菌瘤胃液悬浸成 ２倍浓度的ＦＬＢ。 １．３．３吞噬试验 将标记细菌液加入等体积的原虫悬液中，厌氧 培养（３９℃，５０ ｒ／ｒａｉｎ摇床），分别于０、１５、３０、４５、 ６０和７５ ｒａｉｎ采集样品，所得样品加入等体积甲醛 固定液，固定３０ ｍｉｎ，１５０×ｇ离心１０ ｍｉｎ，分离原 虫，上清液用于游离标记细菌的荧光强度测定。 １．３．４荧光强度测定 采用荧光分光光度计（ＲＦ．—ｊ《一言 ｇ 一００ｃｕｕ ２０ｊ一皿 ５３０１ＰＣ，日本岛津）， 选择波长Ｅｘ＝３５８ ｎｍ，Ｅｍ＝４６１ ｎｍ，发射图谱扫 描范围３４０￣６００ ｎｍ，激发光狭缝宽度５ ｎｍ，发射 光狭缝宽度５ ｎｍ，测定样品的荧光强度。 １．４数据处理 采用Ｍｉｃｒｏｃａｌ（ＴＭ）Ｏｒｉｇｉｎ ６．０软件对所测荧 光强度值进行整理，试验数据采用Ｅｘｃｅｌ软件整理， 运用ＳＰＳＳ １３．０统计软件进行统计分析。数据以平 均值±标准误表示。 ２结果与分析 ２．１ ＤＡＰＩ荧光标记瘤胃细菌标准曲线的建立 ２．１．１标准曲线中标记细菌浓度的设置 参考相关文献得知 ，在粗精比为７：３饲养 条件下，山羊瘤胃内原虫每小时吞噬的细菌数约为 其总量的２０％。因此，以ＰＢＳ（ｐＨ ７．０）悬浸ＦＬＢ 沉淀为原始浓度，设为 。将ＦＬＢ原始液以ＰＢＳ （ｐＨ ７．０）稀释成０、０．１×Ｃｉ、０．２×Ｃｉ、０．３×Ｃｉ、 ０．４×Ｃｉ的浓度梯度。 ２．１．２标准曲线的建立 由图１和图２可以看出，随着标记细菌浓度的 改变，其所测荧光强度也发生了相应的变化，据此建 立的标准曲线线性好，灵敏度高。回归方程为：Ｙ＝ ３４０．３３Ｘ＋２．１４０ ７（Ｒ。＝０．９９５ ２），其中ｙ为标记 细菌的荧光强度， 为初始浓度的稀释倍数。 ２５０ ０Ｏ 熊 ５Ｏ Ｏ０ ０ ３５０ ４００ ４５０ ５００ ５５０ ６００ ６５０ 波长Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ（ｎｍ） 图１ ＤＡＰＩ标记细菌浓度对荧光光谱的影响 Ｆｉｇ．１ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＤＡＰＩ ｌａｂｅｌｅｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉＯｎ ｏｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒａ 墨 图２细菌浓度与其荧光强度之间的相关分析图 Ｆｉｇ．２ Ｔｈｅ ｌｉｎｅａｒ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｇｒａｐｈ ｏｆ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ ２．２不同吞噬时间点游离细菌荧光强度的变化 由图３可以看出，随着吞噬时间的延长，培养液 中所测游离标记细菌的荧光强度随之降低，表明原 虫开始吞噬细菌。７５ ｍｉｎ所测游离细菌荧光强度 值略高于６０ ｍｉｎ的测定值。 《 ．薹 ８ ￡ 图３不同时间点游离细菌荧光强度变化图 Ｆｉｇ．３ Ｃｈａｎｇｅ ｇｒａｐｈ ｏｆ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ｏｆ ｆｒｅｅ ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｉｍｅ ３期 王欢莉等：荧光光度法在瘤胃原虫对细菌吞噬作用研究中的应用 ６１３ ２．３瘤胃原虫对细菌的吞噬率及吞噬量 后主要表现为原虫对已吞噬细菌的消化作用。在 ２．３．１原虫对细菌吞噬量的计算 根据ＤＡＰＩ标记瘤胃细菌的标准曲线，将不同 时间点原虫吞噬的细菌的荧光值折算成相应细菌浓 度值，计算原虫对细菌的吞噬量： 一６０ ｍｉｎ内吞噬量逐渐上升，尚未达到下滑期，此时 在该时间段之内吞噬试验结果的可靠性较高。对吞 噬量与时间进行６０ ｍｉｎ内线性回归分析，其回归方 程为： Ｙ＝６．５６９ ８Ｘ一２３．２９８（Ｒ＝０．９８６）。 ［（Ｂ—Ｃ）一２．１４０ ７］Ｘ Ｃｉ Ｋ ｘ Ｄ 。 式中：ｙ为吞噬量， 为吞噬时间。由回归直线 式中： 为原虫对细菌的吞噬量（ｃｅｌｌｓ／ｃｅｌ１）；Ｂ 为培养液中初始标记细菌荧光强度（Ａｕ）；Ｃ为不同 时间点所测游离标记细菌荧光强度（Ａｕ）；Ｃ／为标记 细菌初始浓度（ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）；Ｋ为常数（３４０．３３ Ａｕ）；Ｄ 为原虫浓度（ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）。 ２．３．２瘤胃原虫对细菌的吞噬率及吞噬量结果 由表１和图４可知，原虫对标记细菌的吞噬量 呈现波动态势，即先上升后下降。这种趋势表明， ６０ ｍｉｎ以前原虫对细菌的吞噬行为占优势，６０ ｍｉｎ 方程可计算原虫的吞噬速率为３７０．８９ ｃｅｌｌｓ／（ｃｅｌ１．ｈ）。 由表１可知，原虫的吞噬速率在６０ ｍｉｎ达到高 峰，３０ ｍｉｎ时的吞噬速率低于１５ ｍｉｎ时的吞噬速 率，３０￣６０ ｍｉｎ时间段内吞噬速率逐渐上升。表明 原虫对细菌的吞噬行为具有一定的调控性，以使其 吞噬和消化最终达到平衡状态，利于其生长、增殖等 生命活动过程。 表１ 瘤胃原虫对细菌的吞噬量和吞噬速率的影响 Ｔａｂｌｅ １ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｒｕｍｅｎ ｐｒｏｔｏｚｏａ ｏｎ ｇｒａｚｉｎｇ ｑｕａｎｔｉｔｙ ａｎｄ ｇｒａｚｉｎｇ ｒａｔｅ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ 同列数据肩标相邻表示差异显著（Ｐ＜Ｏ．０５），相隔表示差异极显著（Ｐ＜Ｏ．０１），相同表示差异不显著（Ｐ＞Ｏ．０５）。 Ｉｎ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｃｏｌｕｍｎ，ｖａｌｕｅｓ ｗｉｔｈ ａｄｊａｃｅｎｔ ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔｓ ｍｅａｎｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（Ｐ＜Ｏ．０５），ｗｉｔｈ ａｐａｒｔ ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔｓ ｍｅａｎｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（Ｐ＜Ｏ．０１），ａｎｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔｓ ｍｅａｎｔ ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（Ｐ＞Ｏ．０５）． — 乔噬量 （Ｊｒａｚｉｎｇ ｑｕａｎＵｔｙ 十脚叫 线性（预测吞噬量） ３ 讨 论 ＤＡＰＩ荧光标记细菌口 具有高度专一性和敏 感性，荧光分光光度计能快捷地检测其荧光强度。 研究表明荧光标记的物质在一定的浓度范围内，其 咖 所测荧光强度与浓度之间存在线性相关口 删，据此 能对标记物进行定量分析。本研究中根据前人对原 堇 时 Ｔｉｍｅ（ｍｉｎ） 虫吞噬速率的研究，对ＤＡＰＩ标记的瘤胃细菌进行 。 梯度稀释，在稀释浓度范围内，标记细菌的荧光强度 与其浓度之间存在线性相关。因此，在此前提下研 究原虫对细菌的吞噬作用是可行的。 荧光计数法广泛应用于原虫对细菌的吞噬研 图４原虫对细菌吞噬量随时间变化回归分析图 Ｆｉｇ．４ Ｔｈｅ ｌｉｎｅａｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｇｒａｐｈ ｏｆ ｔｈｅ ｑｕａｎｔｉｔｙ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ ｇｒａｚｅｄ ｂｙ ｐｒｏｔｏｚｏａ ｃｈａｎｇｅｄ ｗｉｔｈ ｔｉｍｅ 究ｌ４ ¨］。本试验首次采用荧光光度法研究瘤胃 ６１４ 动物营养学报 ２２卷 原虫对细菌的吞噬作用，与荧光计数法相比较，该方 法操作简便，可以减少试验中的人为误差，较客观地 反映原虫对细菌的吞噬过程，同时还可长时间对原 虫的吞噬行为进行研究，克服了计数法中由于原虫 体内细菌堆积、细菌残骸的存在等导致研究时间较 短的不足，因此，从理论上讲该方法比荧光计数法更 可靠。 试验过程中，前３０ ｍｉｎ表现出原虫对细菌的吞 噬速率趋势与先前报道一致，即先上升后下降。但 由于受荧光计数方法的限制，先前报道未反映吞噬 后期瘤胃原虫对细菌的摄食行为。本研究发现吞噬 ３０ ｒａｉｎ后，吞噬速率再次出现上升趋势，但４５ ｒａｉｎ 后上升趋势逐渐变缓。其原因可能是原虫对细菌的 吞噬、消化是同时存在的过程，且它们的优势作用交 替表现出来。６０ ｒａｉｎ后吞噬量下降，原因可能是原 虫对细菌的吞噬达到饱和，此时原虫主要进行细菌 的消化和排泄作用，因此推断在粗精比为７：３的条 件下，徐淮山羊瘤胃内原虫对细菌的最大吞噬量为 ３７０．８９ ｃｅｌｌｓ／ｃｅｌｌ。 ４ 结 论 ①荧光强度测定法可应用于瘤胃原虫对细菌 的吞噬研究。 ②粗精比为７：３的条件下，徐淮山羊瘤胃内 原虫对细菌的吞噬在６０ ｍｉｎ达到饱和，其最大吞噬 量为３７０．８９ ｃｅｌｌｓ／ｃｅｌｌ。 参考文献： ［１］Ｊｏｕｎａｙ Ｊ Ｐ．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｒｕｍｅｎ ｐｒｏｔｏｚｏａ ｏｎ ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｕ— ｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ｒｕｍｉｎａｎｔｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ， １９９６，１２６：１ ３３５ Ｓ一１ ３３６ Ｓ． ［２］Ｌｅｎｇ Ｒ Ａ．Ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ｐｒｏｔｏｚｏａ ｉｎ ｔｈｅ ｒｕｍｅｎ ｏｆ ｓｈｅｅｐ［Ｊ］．Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，１９８２，４８： ３９９．４１５． ［３］Ｖｅｉｒａ Ｄ Ｍ，Ｉｖａｎ Ｍ，Ｊｕｉ Ｐ Ｙ．Ｒｕｍｅｎ ｃｉｌｉａｔｅ ｐｒｏｔｏ— ｚｏａ：ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔｏｍａｃｈ ｏｆ ｓｈｅｅｐ Ｉ－Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８３，６６：１ ０１５— １ ０２２． ｒ ４］Ｓｈｅｒｒ Ｂ Ｆ，Ｓｈｅｒｒ Ｅ Ｂ，Ｆａｌｌ Ｒ Ｄ．Ｕｓｅ ｏｆ ｍｏｎｏｄｉｓ． ｐｅｒｓｅｄ。ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｌｙ ｌａｂｅｌｌｅｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ｔｏ ｅｓｔｉｍａｔｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｐｒｏｔｏｚｏａ ｂａｃｔｅｒｉｏｒｙ［Ｊ］．Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎ－ ｍｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９８７，５３：９５８—９６５． ［５］ Ｎｙｇａａｒｄ Ｋ，Ｈｅｓｓｅｎ Ｄ Ｏ．Ｕｓｅ ｏｆ １４Ｃ・ｐｒｏｔｅｒｉｎ－ｌａｂｅｌｌｅｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ｆｏｒ ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｒａｔｅｓ ｂｙ ｈｅｔｅｒｏ・ ｔｒｏｐｈｉｃ ａｎｄ ｍｉｘｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆｌａｇｅｌｌａｔｅｓ［Ｊ］．Ｍａｒｉｎｅ Ｅ・ ｃｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ Ｓｅｒｉｅｓ，１９９０，６８：７－１４． ［６］ Ｌａｎｄｒｙ Ｍ Ｒ，Ｈａｓｓ Ｌ Ｗ，Ｆａｇｅｒｎｅｓｓ Ｖ Ｌ．Ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｌａｎｋｔｏｎ ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ：ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｋａｎｅｌｈｅ Ｂａｙ，Ｈａｗａｉｉ，［Ｊ］．Ｍａｒｉｎｅ Ｅｃｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ Ｓｅｒｉｅｓ，１９８４，１６：１２７—１３３． ［７］ Ｗａｎｇ Ｍ Ｚ．Ｔｈｅ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｒｅｐｏｒｔ ｏｎ ｒｕｍｅｎ ｐｒｏｔｏ— ｚｏａ ｇｒａｚｉｎｇ ｒａｔｅ ｏｎ ｂａｃｔｅｒｉａ ｗｉｔｈ ａ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ・・ｌａ－・ ｂｅｌｌｅｄ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ［Ｊ］．Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｈｉｎａ， ２００８，７（６）：７６８—７７４． ［８］ 洪华生，柯林，黄邦钦，等．用改进的荧光标记技 术测定具沟急游虫的摄食速率［Ｊ］．海洋与湖沼， ２００１，３２（３）：２６０—２６６． ［９］ Ｅｖｅｌｙｎ Ｂ Ｓ，Ｂａｒｒｙ Ｆ Ｓ．Ｐｒｏｔｉｓｔａｎ ｇｒａｚｉｎｇ ｒａｔｅ ｖｉａ ｕｐｔａｋｅ ｏｆ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｌｙ ｌａｂｅｌｌｅｄ ｐｒｅｙＥＭ］．Ｉｎ：Ｐａｕｌ Ｆ Ｋ，Ｂａｒｒｙ Ｆ Ｓ，Ｅｖｅｌｙｎ Ｂ Ｓ，ｅｔ ａ１．，ｅｄｓ．Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ａｑｕａｔｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｅｃｏｌｏｇｙ．Ｂｏｃａ Ｒｏ－ ｔｏｎ：Ｌｅｗｉｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９３：６９５．７０１． Ｅｌｏ］ Ｓｉｍｅｋ Ｋ，Ｂｏｂｋｏｖａ Ｊ，Ｍａｃｅｋ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｃｉｌｉａｔｅ ｇｒａｚ— ｉｎｇ ｏｎ ｐｉｃｏｐｌａｎｋｔｏｎ ｉｎ ａ ｅｕｔｒｏｐｈｉｃ ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｓｕｍｍｅｒ ｐｈｙｔｏｐｌａｎｋｔｏｎ ｍａｘｉｍｕｍ：ａ ｓｔｕｄｙ ａｔ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｅｓ ａｎｄ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ ｌｅｖｅｌ［Ｊ］．Ｌｉｍｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ０－ ｃｅａｎｏｇｒａｐｈｙ，１９９５，４０：１ ０７７・１ ０９０． ［１１］ 曹恒春，王洪荣，王梦芝．用荧光标记法研究瘤胃原 虫吞噬细菌的初探［Ｊ］．饲料工业，２００８，２３：２４—２６． ，［１２１ Ｋａｒｅｎ Ｇ Ｐ，Ｙｖｅｔｔｅ Ｓ Ｆ．Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ＤＡＰＩ ｆｏｒ ｉｄｅｎｔｉ． ｆｙｉｎｇ ａｎｄ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ａｑｕａｔｉｃ ｍｉｃｒｏｆｌｏｒａｌ，Ｊ］．Ｌｉｍｎｏｌｏ・ ｇＹ ａｎｄ Ｏｃｅａｎｏｇｒａｐｈｙ，１９８０，２５（５）：９４３—９４８． ［１３］ Ａｎｎｅｔｔｅ Ｗ Ｃ．Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｎ ｎａｔｕ－ ｒａｌ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ ｂｙ ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｏｆ ＤＮＡ ＿Ｊ］．Ｌｉｍｎｏｌ Ｏｃｅａｎｏｇｒ，１９８０，２５（５）：９４８．９５１． ［１４］ 李宏标．原子荧光法测定海水中的砷Ｉ－Ｊ］．黑龙江环 境通报，２００５，２９（２）：３５．３７． ［１５］ 汤薇，刘全宏，刘书瑗．荧光光度法测定血卟啉在 荷瘤小鼠体内的分布［Ｊ］．西北大学学报（自然科学 版），２００５，３５（４）：４３６—４３９． ［１６］ 任光明，闫永正，张海容．荧光法测定啤酒中的草酸 ［Ｊ］．酿酒科技，２００５，１２：１１０．１１１． ［１７］ 张丽霞，贾明，夏文娟，等．茶多酚绿色荧光特性 研究［Ｊ］．茶叶科学，２００４，２４（４）：２８８．２９４． ［１８］ 廖律，周明达，肖 劲，等．米糠中阿魏酸的提取 及荧光分光光度法检测Ｉ－Ｊ］．食品科学，２００７，２８ （３）：２８２．２８４． ３期 王欢莉等：荧光光度法在瘤胃原虫对细菌吞噬作用研究中的应用 ６１５ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ ｉｎ Ｓｔｕｄｙｉｎｇ Ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ ｏｆ Ｒｕｍｅｎ Ｐｒｏｔｏｚｏａ ｏｎ Ｂａｃｔｅｒｉａ ＷＡＮＧ Ｈｕａｎｌｉ ＷＡＮＧ Ｈｏｎｇｒｏｎｇ Ｌ１Ｕ Ｘｉａｎｇ ＳＯＮＧ Ｒｏｎｇｙｕａｎ ＷＡＮＧ Ｊｉａｎｆｅｉ 儿ＡＮＧ Ｘｉａｏｂｏ （１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｙａｎｇｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａｎｇｚｈｏｕ ２２５００９，Ｃｈｉｎａ；２．Ｊｉａｎｇｓｕ Ｙａｎｃｈｅｎｇ Ｍｉｄｄｌｅ Ｓｃｈｏｏｌ Ｙａｎｃｈｅｎｇ ２２４００１，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｗａｓ ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ ｔｏ ｅｘａｍｉｎｅ ｔｈｅ ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ ｕｓｅｄ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ ｏｆ ｒｕｍｅｎ ｐｒｏｔｏｚｏａ ｏｎ ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｆｏｕｒ ｈｅａｌｔｈｙ Ｘｕｈｕａｉ ｇｏａｔｓ ｗｉｔｈ ｐｅｒｍａｎｅｎｔ ｒｕｍｉｎａｌ ｃａｎｎｕｌａｓ ｗｅｒｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ａｓ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｉｍａｌｓ ｔｏ ｏｂｔａｉｎ ｒｕｍｅｎ ｐｒｏｔｏｚｏａ ａｎｄ ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｔｈｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ ｌａｂｅｌｅｄ ｂｙ ＤＡＰＡ ｗａｓ ｔｅｓｔｅｄ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｐｈａｇｏ— ｃｙｔｏｓｉｓ ｏｆ ｒｕｍｅｎ ｐｒｏｔｏｚｏａ ｏｎ ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｌｉｎｅａｒ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｌａｂｅｌｅｄ ｂｙ ＤＡＰＩ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ（Ｒ。＝０．９９５ ２）．Ｔｈｅ ｇｒａｚｉｎｇ ｒａｔｅ ｏｆ ｐｒｏｔｏｚｏａ ｗａｓ ３７０．８９ ｃｅｌｌｓ／（ｃｅｌｌ・ｈ）ｆｏｒ Ｘｕｈｕａｉ ｇｏａｔｓ ｆｅｄ ｔｈｅ ｄｉｅｔ ｗｉｔｈ ｆｏｒａｇｅ：ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ ｏｆ ７：３．Ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｖｏｌａｔｉｌｉｔｙ ｏｎ ｇｒａｚ— ｉｎｇ ｒａｔｅ ｏｆ ｒｕｍｅｎ ｐｒｏｔｏｚｏａ ｏｎ ｂａｃｔｅｒｉａ ｏｆ Ｘｕｈｕａｉ ｇｏａｔｓ．Ｇｒａｚｉｎｇ ｑｕａｎｔｉｔｙ ｒｅａｃｈｅｄ ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｎ ６０ ｍｉｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｌａｒｇｅｓｔ ｇｒａｚ－ ｉｎｇ ｑｕａｎｔｉｔｙ ｗａｓ ３７０．８９ ｃｅｌｌｓ／ｃｅｌ１．Ｉｔ ｗａｓ ｃｏｎｃｌｕｄｅｄ ｔｈａｔ ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ ｉｎ ｓｔｕｄｙｉｎｇ ｇｒａｚｉｎｇ ｒａｔｅ ｏｆ ｒｕｍｅｎ ｐｒｏｔｏｚｏａ ｏｎ ｂａｃｔｅｒｉａ．［－Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，２０１０，２２（３）：６１１—６１５］ Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ；Ｒｕｍｅｎ ｐｒｏｔｏｚｏａ；Ｇｒａｚｉｎｇ ｒａｔｅ ＊Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ，ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ，Ｅ・ｍａｉｌ：ｈｒｗａｎｇ＠ｙｚｕ．ｅｄｕ．ｃｎ （编辑 朱 虹）
