(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 110305055 A(43)申请公布日 2019.10.08
(21)申请号 201910626990.2(22)申请日 2019.07.12
(71)申请人 济南大学
地址 250022 山东省济南市市中区南辛庄
西路336号(72)发明人 林伟英 王伟珊 刘勇 牛杰 (74)专利代理机构 济南泉城专利商标事务所
37218
代理人 李桂存(51)Int.Cl.
C07D 209/08(2006.01)C09K 11/06(2006.01)G01N 21/64(2006.01)
权利要求书1页 说明书3页 附图3页
(54)发明名称
一种识别线粒体粘度的荧光探针及其制备方法与应用(57)摘要
本发明涉及一种识别线粒体粘度的荧光探针及其制备方法与应用，尤其涉及一种基于吲哚类化合物识别线粒体粘度的荧光探针在体内与体外的研究；属于有机小分子荧光探针领域。所述的探针为EIMV，其化学结构式如式（I）所示。本发明还提供了该探针的制备方法，并公开了所述荧光探针在检测过程中荧光变化及选择性等光谱性质。实验证明：本发明提供的识别线粒体且具有能够检测粘度的荧光探针，并且能够实现细胞内成像，为生物学成像应用奠定了理论基础，预示其在荧光生物标记领域具有潜在的应用价
CN 110305055 A值。（I）。
CN 110305055 A
权 利 要 求 书
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1.一种识别线粒体粘度的荧光探针，其特征在于，所述的荧光探针命名为EIMV，其化学结构式如式（I）所示：
（）。
2.权利要求1所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将化合物1与吡啶盐2以甲醇做溶剂，反应，在氮气保护下加热回流；柱层层析得到化合物EIMV；
。
3.权利要求1所述的荧光探针在光谱与细胞方面的应用。
4.权利要求1所述的荧光探针在细胞线粒体粘度的测定上的应用，其特征在于，所述荧光探针以荧光增强的方式实现对线粒体粘度的识别，应用于细胞线粒体粘度的测定。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的荧光探针可应用于活细胞线粒体黏度测定。
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说 明 书
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一种识别线粒体粘度的荧光探针及其制备方法与应用
技术领域
[0001]本发明涉及一种识别线粒体粘度的荧光探针及其制备方法与应用，尤其涉及一种基于吲哚类化合物识别线粒体粘度的荧光探针在体内与体外的研究；属于有机小分子荧光探针领域。
背景技术
[0002]线粒体基质黏度通过改变线粒体网络结构与线粒体呼吸状态密切相关，通过线粒体基质黏度的改变可以调节代谢产物的扩散。线粒体相关黏度异常可导致糖尿病、神经退行性疾病和癌症。因此，开发有效的技术来监测线粒体黏度变化是非常必要的。[0003]目前，传统的机械测量方法有很多，如滴球式粘度计、毛细管粘度计等。然而，这些方法都只适用传统的液体而不适用于活细胞，因此需要开发新的工具来检测细胞内粘度。荧光探针由于具有高灵敏度、高选择性以及实时成像的优点，因此作为一种强大的工具来检测活细胞的细胞器粘度。分子转子在低粘度介质中是无发射波的，在粘性介质中具有强荧光，为检测细胞内黏度提供了一种有用的方法。大多数探针在细胞中都有非特异性的定位，不适合用于检测特定器官器的微粘度。到目前为止，虽然有许多线粒体黏度探针的报道，但区分正常细胞和肿瘤细胞以及进一步区分正常器官和病变器官的情况很少见。因此，黏度敏感的线粒体靶向探针对具有抗干扰能力的线粒体仍然具有挑战性。
发明内容
[0004]针对现有技术的不足，本发明通过分子设计合成了线粒体靶向的粘度荧光探针，随着粘度的增加，探针的荧光强度显著增强，具有高度的灵敏性。并且可以对细胞内微环境的粘度进行荧光成像。
[0005]一种识别线粒体粘度的荧光探针，命名为EIMV，其化学结构式如式（I）所示：
（）
上述荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
将化合物1与吡啶盐2以甲醇做溶剂，反应，在氮气保护下加热回流；柱层层析得到化合物EIMV。
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说 明 书
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上述荧光探针在光谱与细胞方面的应用。
[0007]上述荧光探针以荧光增强的方式实现对线粒体粘度的识别，应用于细胞线粒体粘度的测定。
[0008]上述荧光探针也可应用于活细胞线粒体黏度测定。[0009]本发明所述的荧光探针EIMV在纯水体系内荧光较弱，而在粘度强的丙三醇溶液中荧光增强，证明该探针可能是粘度探针（图2）。[0010]在粘度选择性试验中，当用510nm光激发，只有在粘度增强时发生86倍的荧光增强。（图3）；随着缓冲液PBS与丙三醇体系种丙三醇含量升高，荧光强度明显增强（图4）。[0011]在细胞内进行成像时，探针与商业的线粒体探针进行共定位实验可以发现共定位系数可以达到0.90（图5）；当激发波长为560nm时，探针在细胞内有微弱的荧光，当用莫能菌素和制霉菌素处理后荧光明显增强（图6）。[0012]本发明的有益效果：
（1）本发明提供的化合物能够识别线粒体，且检测粘度的荧光探针；（2）能够实现细胞内成像，为生物学成像应用奠定了理论基础，预示其在荧光生物标记领域具有潜在的应用价值；
（3）该化合物能够高选择性地识别粘度，将为以后新型荧光探针的合成提供了新的发展方向。
附图说明
[0013]图1：EIMV的核磁共振氢谱图；
图2：探针在PBS与丙三醇溶液中的吸收与发射光谱；图3：探针对粘度的选择性。激发波长为510 nm；探针母液的浓度：10-3M，选择性离子的浓度为0.4 mM；
图4：探针在PBS与丙三醇不同配比溶液中荧光光谱；激发波长为510nm；探针母液的浓度:10-3M；图5：细胞的共定位实验；图6：细胞粘度变化的生物成像应用。具体实施方式[0014]实施例1
EIMV的合成：将0.32g (2mmol)化合物1，0.，95g (3mmol) 化合物2，溶于20mL甲醇中，在氮气保护下进行加热回流反应，反应过夜，反应结束。将粗品通过柱层析法，用CH2Cl2/CH3OH=70:1的展
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说 明 书
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开剂进行分离提纯得到化合物EIMV。产率：45%。H NMR (400 MHz， DMSO-d6) δ 12.85 (s， 1H)， 10.58 (s， 1H)， 8.80 (d， J = 16.0 Hz， 2H)， 7.78 (d， J = 8.0 Hz， 1H)， 7.72 (d， J = 8.0 Hz， 1H)， 7.55 (t， J = 8.0 Hz， 1H)， 7.48 (t， J = 6.0 Hz， 1H)， 7.14 (t， J = 8.0 Hz， 1H)， 7.06 (d， J = 8.0 Hz， 1H)， 6.76 (d， J = 8.0 Hz， 1H)， 4.45 (d， J = 6.6 Hz， 2H)， 3.34 (s， 1H)， 1.78 (s， 6H) 1.43 (t， J = 8.0 Hz， 3H)。[0015]实施例2
EIMV在纯水体系内对粘度的响应：预先准备1份10 mL的10-3 M本发明的探针N， N-二甲基甲酰胺溶液，然后分别取12μL加入两个相同的5mL容量瓶中，其中一个瓶中的用PBS的溶液稀释到3mL，另一个瓶用丙三醇稀释到3mL，然后进行吸收与发射光谱的检测，结果见图2。[0016]结论： 表明该探针能够检测粘度。[0017]实施例3
EIMV对粘度的选择性(见图3)：其中：激发波长为510 nm；探针母液的浓度：10-3M。取12μL探针母液加PBS稀释到3ml进行，后取3mL的上述稀释液，加入各种离子进行光谱测试，其中各种离子浓度均为0.4mM，取12μL探针母液加丙三醇稀释到3ml进行荧光测试。[0018]结论：测试结果表明，探针EIMV对粘度具有高选择性。[0019]实施例 4
化合物EIMV粘度荧光探针随粘度的增加荧光谱图的变化取实施例1制备的粘度荧光探针溶于N， N-二甲基甲酰胺中，制成1mmol/L 储备液。从储备液中取出12μL 加入到3mL 的离心管当中，用PBS和甘油配成不同比例的粘度值，测量其荧光性质。荧光光谱如图4 所示。[0020]结论：随着粘度的增加荧光逐渐增强。[0021]实施例5
生物成像：活细胞染色实验将探针配成1mMDMF母液，染色时用1mL培养基稀释。
[0022]将接种好的细胞在设定量浓度的探针分子溶液37ºC孵育30 min，用PBS洗3-5次；然后用荧光显微镜进行荧光成像。激发波长为560nm，吸收在570-620 nm。[0023]商用线粒体探针(Mito-tractor)进行共定位实验，由共聚焦荧光显微镜下成像图可知（图5），该试验证明了探针能很好的定位于线粒体（见图5）。共定位系数高达0.9。[0024]结论：说明探针成功定位于线粒体中。[0025]实施例6
生物成像：活细胞染色实验将探针配成1 mM DMF母液，染色时用1mL培养基稀释。[0026]取三组孵育时间相同的细胞进行实验，一组加制霉菌素(10um)，一组加莫奈菌素(10um)，一组空白，孵育30min后，再将细胞在设定量浓度的探针分子溶液37ºC孵育30 min，用PBS洗3-5次， 然后用荧光显微镜进行荧光成像。激发波长为560nm，吸收在570-620 nm。加入制霉菌素与莫奈菌素的细胞与空白组相比荧光强度明显增强（见图6）。[0027]结论：说明探针能够检测粘度。
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图3
图4
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