(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 106983867 A(43)申请公布日 2017.07.28
(21)申请号 201710117653.1(22)申请日 2017.03.01
(71)申请人 天津师范大学
地址 300387 天津市西青区宾水西道393号(72)发明人 王魁 崔建华
(74)专利代理机构 天津市杰盈专利代理有限公
司 12207
代理人 朱红星(51)Int.Cl.
A61K 47/36(2006.01)A61K 47/22(2006.01)A61K 9/51(2006.01)A61K 31/538(2006.01)
权利要求书1页 说明书5页 附图7页
(54)发明名称
一种透明质酸酶调控的超分子纳米粒子及制备方法和应用
(57)摘要
本发明公开了一种透明质酸酶调控的超分子纳米粒子，其特征在于：构筑单元以杯吡啶为主体，以透明质酸钠为客体，通过主−客体包结配位相互作用构筑超分子纳米粒子；所述的超分子纳米粒子的粒径约为70 nm，所述杯吡啶和透明质酸钠的浓度分别为0.10 mmol/L和1.40 μmol/L。再将透明质酸酶加入超分子纳米粒子溶液中即可使超分子纳米粒子溶液中的超分子纳米粒子几乎完全解聚。本发明的优点是：该超分子纳米粒子制备方法简便，主、客体原料用量少；该超分子纳米粒子具有很好的稳定性，对透明质酸酶具有良好的响应性，可应用于疏水药物模型的负载和可控释放，因而其在生物医药领域具有重大的意义和广阔的应用前景。
CN 106983867 ACN 106983867 A
权 利 要 求 书
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1.一种透明质酸酶调控的超分子纳米粒子，其特征在于：构筑单元以杯吡啶为主体，以透明质酸钠为客体，通过主−客体包结配位相互作用构筑超分子纳米粒子；所述的超分子纳米粒子的粒径约为70 nm，所述杯吡啶和透明质酸钠的浓度分别为0.10mmol/L和1.40mol/L。
2.权利要求1所述透明质酸酶调控的超分子纳米粒子的制备方法，其特征在于：将杯吡啶和透明质酸钠分别溶解于水中，得到杯吡啶溶液和透明质酸钠溶液，将杯吡啶溶液逐滴加入到透明质酸钠溶液中，均匀混合后得到超分子纳米粒子溶液目标物，其中，超分子纳米粒子溶液的pH值为6，杯吡啶和透明质酸钠的浓度分别为0.10 mmol/L和1.40 mol/L。
3.一种采用权利要求1所述透明质酸酶调控的超分子纳米粒子将超分子纳米粒子进行解聚的制备方法，其特征在于：将透明质酸酶加入超分子纳米粒子溶液中，控制温度为37℃，作用21分钟，即可使超分子纳米粒子溶液中的超分子纳米粒子几乎完全解聚，其中透明质酸酶在超分子纳米粒子溶液中的浓度为1 U/mL-10 U/mL。
4.权利要求1所述的透明质酸酶调控的超分子纳米粒子在疏水药物模型负载和可控释放方面的应用。
5.权利要求4所述的应用，其中所述的疏水药物模型负载指的是：尼罗红负载到上述超分子纳米粒子中；所述的可控释放：指的是在负载有疏水药物模型的超分子纳米粒子中加入透明质酸酶，可使负载有疏水药物模型的超分子纳米粒子几乎完全解聚，并全部释放所负载的疏水药物。
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说 明 书
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一种透明质酸酶调控的超分子纳米粒子及制备方法和应用
[0001]
本专利得到国家自然科学基金青年科学基金项目（21402141）和天津市应用基础
与前沿技术研究计划(青年项目)（15JCQNJC05400）资助。
技术领域
[0002]本发明属于纳米超分子材料制备技术领域，特别是一种透明质酸酶调控的超分子纳米粒子及制备方法和应用。
背景技术
[0003]超分子组装体系因其在化学、生物和材料科学等领域有着诸多的潜在应用价值而受到广泛的关注，参见：1）B.-P. Jiang, D.-S. Guo, Y.-C. Liu, K.-P. Wang, Y. Liu. ACS Nano. 2014, 8, 1609−1618；2）Y.-X. Wang, Y.-M. Zhang, Y. Liu. J. Am. Chem. Soc. 2015, 137, 4543−4549。超分子组装体对于外界刺激信号的响应是否灵敏是其能否实现功能应用的重要指标，参见：1）A. Mueller, D. F. O'Brien. Chem. Rev.2002, 102, 727−757；2）D. M. Vriezema, M. C. Aragonès, J. A. A. W. Elemans, J. J. L. M. Cornelissen, A. E. Rowan, R. J. M. Nolte. Chem. Rev.2005, 105, 1445−1489；3）X. Guo, F. C. Szoka. Acc. Chem. Res.2003, 36, 335−341。在众多的外界刺激信号中，酶响应信号不但是生物相容的，而且具有高的灵敏度和选择性。此外，许多疾病都与酶的非正常表达有关，参见：1）P. K. Buamah, A. W. Skillen. Clin. Chem.1985, 31, 876−877；2）A. F. Paszcuk, N. L. M. Quintão, E. S. Fernandes, L. Juliano, K. Chapman, P. Andrade-Gordon, M. M. Campos, N. Vergnolle, J. B. Calixto. Eur. J. Pharmacol.2008, 581, 204−215；3）Z. Lu, F. Wu, X. Miao, W. Yu. Clin. J. Med. Offic.2008, 36, 488−490，因而设计酶响应的超分子组装体在生物医药领域具有重大的意义和广阔的应用前景。目前，基于磺化杯芳烃和阳离子客体的识别已经成功构筑了诸多酶响应的超分子组装体，参见：1）K. Wang, D.-S. Guo, M.-Y. Zhao, Y. Liu. Chem. Eur. J.2016, 22, 1475−1483；2）D.-S. Guo, K. Wang, Y.-X. Wang, Y. Liu. J. Am. Chem. Soc.2012, 134, 10244−10250。然而，基于阴离子识别的酶响应超分子组装体的构筑还鲜有报道。
[0004]透明质酸钠是广泛存在于人体内的生理活性物质,是由葡糖醛酸和乙酰氨基葡糖组成的双糖单位连接而成的一种高分子黏多糖。大量的临床应用结果表明,透明质酸钠对治疗骨性关节炎、类风湿性关节炎等关节疾病效果明显、安全，参见：1）T. Nonaka, H. Kikuchi, T. Ikeda, Y. Okamoto, C. Hamanishi, S. Tanaka. J. Rheumatol.2000, 27, 997−1004；2）M. Goto, T. Hanyu, T. Yoshio, H. Matsuno, M. Shimizu, N. Murata, S. Shiozawa, T. Matsubara, S. Yamana, T. Matsuda. Clin. Exp. Rheumatol.2001, 19, 377−383。此外，在许多癌细胞表面，透明质酸钠受体过度表达，透明质酸酶在癌细胞降解透明质酸钠的过程中起到重要作用，参见：1）A. G. Bharadwaj, K. Rector, M. A. Simpson, J. Biol. Chem.2007, 282, 20561−20572；2）A. Ouhtit, Z.
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Y. Abd Elmageed, M. E. Abdraboh, T. F. Lioe, M. H. G. Raj, Am. J. Pathol. 2007, 171, 2033−2039。因此，透明质酸酶响应的超分子组装体在生物医疗领域有着广阔的应用前景。
[0005]杯吡啶是一类富含吡啶阳离子的环状化合物，具有良好的水溶性以及和阴离子客体键合的潜能。该化合物可以以3-溴甲基吡啶为原料简便高效的进行合成，参见：S. Shinoda, M. Tadokoro, H. Tsukube, R. Arakawa. Chem. Commun.1998, 181−182。然而，基于杯吡啶阴离子识别的超分子组装体的构筑还未有报道。发明内容
[0006]本发明的目的是针对上述技术分析，提供一种透明质酸酶调控的超分子纳米粒子及制备方法和应用，该超分子纳米粒子系基于杯吡啶和透明质酸钠二元超分子组装的纳米粒子，透明质酸钠的存在可以诱导杯吡啶发生聚集从而形成二元超分子纳米粒子；该超分子纳米粒子具有很好的稳定性，此外，该超分子纳米粒子对透明质酸酶具有良好的响应性，可应用于疏水药物模型的负载和可控释放，因而其在生物医药领域具有重大的意义和广阔的应用前景。
[0007]为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：
本发明公开了一种透明质酸酶调控的超分子纳米粒子，其构筑单元以杯吡啶为主体，以透明质酸钠为客体，通过主−客体包结配位相互作用构筑超分子纳米粒子；所述的超分子纳米粒子的粒径约为70 nm；杯吡啶和透明质酸钠的浓度分别为0.10 mmol/L和1.40 μmol/L。
[0008]本发明进一步公开了一种所述透明质酸酶调控的超分子纳米粒子的制备方法，将杯吡啶和透明质酸钠分别溶解于水中，得到杯吡啶溶液和透明质酸钠溶液，将杯吡啶溶液逐滴加入到透明质酸钠溶液中，均匀混合后得到超分子纳米粒子溶液目标物，其中，超分子纳米粒子溶液的pH值为6，杯吡啶和透明质酸钠的浓度分别为0.10 mmol/L和1.40 μmol/L。[0009]本发明更进一步公开对透明质酸酶调控的超分子纳米粒子解聚的制备方法：
将透明质酸酶加入超分子纳米粒子溶液中，控制温度为37℃，作用21分钟，即可使超分子纳米粒子溶液中的超分子纳米粒子几乎完全解聚，其中透明质酸酶在超分子纳米粒子溶液中的浓度为1 U/mL-10 U/mL。
[0010]本发明进一步公开了透明质酸酶调控的超分子纳米粒子在疏水药物模型负载和可控释放方面的应用。实验结果显示：疏水药物模型尼罗红可以负载到上述超分子纳米粒子中，在负载有疏水药物模型的超分子纳米粒子中加入透明质酸酶，可使负载有疏水药物模型的超分子纳米粒子几乎完全解聚，并全部释放所负载的疏水药物模型。[0011]本发明的优点是：基于杯吡啶和透明质酸钠二元超分子组装构筑的纳米粒子，制备方法简便，主、客体原料用量少；该超分子纳米粒子具有很好的稳定性，对透明质酸酶具有良好的响应性，可应用于疏水药物模型的负载和可控释放，因而其在生物医药领域具有重大的意义和广阔的应用前景。
附图说明
[0012]图1为杯吡啶在水溶液中在350 nm波长处的透光率随其浓度变化的实验图；
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图2为透明质酸钠在水溶液中在350 nm波长处的透光率随其浓度变化的实验图；图3为在固定透明质酸钠的浓度为0.52 μmol/L的水溶液中逐渐加入杯吡啶，体系在350 nm波长处的透光率随杯吡啶浓度变化的实验图；
图4为在固定杯吡啶的浓度为0.10 mmol/L的水溶液中逐渐加入透明质酸钠，体系在350 nm波长处的透光率随透明质酸钠浓度变化的实验图；
图5为固定杯吡啶和透明质酸钠的浓度分别为0.10 mmol/L和1.40 μmol/L时，该水溶液在700 nm波长处的透光率随体系pH变化的实验图；
图6为杯吡啶和透明质酸钠二元超分子组装的纳米粒子的高分辨透射电子显微镜图像；
图7为杯吡啶和透明质酸钠二元超分子组装的纳米粒子的扫描电子显微镜图像；图8为固定杯吡啶和透明质酸钠的浓度分别为0.10 mmol/L和1.40 μmol/L时，该水溶液在350 nm波长处的透光率随时间变化的实验图；
图9为往在最佳条件下构筑的杯吡啶和透明质酸钠超分子纳米粒子体系中加入透明质酸酶后（加入后透明质酸酶的浓度分别为1 U/mL，3 U/mL和10 U/mL），体系在350 nm波长处的透光率随时间变化的实验图；
图10为往在最佳条件下构筑的杯吡啶和透明质酸钠超分子纳米粒子体系中加入透明质酸酶21分钟后的高分辨透射电子显微镜图像；
图11为往在最佳条件下构筑的杯吡啶和透明质酸钠超分子纳米粒子体系中加入透明质酸酶21分钟后的扫描电子显微镜图像；
图12为往在最佳条件下构筑的杯吡啶和透明质酸钠超分子纳米粒子体系中加入透明质酸酶和失活的透明质酸酶后（加入后透明质酸酶和失活的透明质酸酶的浓度均为10 U/mL），体系在350 nm波长处的透光率随时间变化的实验图；
图13为尼罗红水溶液中的尼罗红和负载于杯吡啶和透明质酸钠超分子纳米粒子中的尼罗红在550 nm波长处的吸光度随时间变化值（5分钟时的吸光度减去10分钟时的吸光度）的对比图；
图14为尼罗红水溶液中的尼罗红和加入透明质酸酶后（加入后透明质酸酶的浓度为10 U/mL）负载于杯吡啶和透明质酸钠超分子纳米粒子中的尼罗红在550 nm波长处的吸光度随时间变化的对比图。
具体实施方式
[0013]下面结合实施例说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定。其中透明质酸钠购自华熙福瑞达生物医药有限公司，分子量为77 KDa；透明质酸酶（来源于牛睾丸）购自Sigma–Aldrich公司；杯吡啶是以3-溴甲基吡啶为原料简便高效的进行合成的，参见：S. Shinoda, M. Tadokoro, H. Tsukube, R. Arakawa. Chem. Commun. 1998, 181−182。[0014]实施例1：
一种透明质酸酶调控的超分子纳米粒子，其特征在于：构筑单元以杯吡啶为主体，以透明质酸钠为客体，通过主−客体包结配位相互作用构筑超分子纳米粒子。其制备方法如下：
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（一）浓度、pH条件选择（1）图1为杯吡啶在水溶液中在350 nm波长处的透光率随其浓度变化的实验图，如图1所示，杯吡啶自身在水溶液中在350 nm波长处的透光率随其浓度增加并不发生变化，表明杯吡啶自身在水溶液中不具有临界聚集浓度，杯吡啶自身在水溶液中不能自聚集。图2为透明质酸钠在水溶液中在350 nm波长处的透光率随其浓度变化的实验图，如图2所示，透明质酸钠自身在水溶液中在350 nm波长处的透光率随其浓度增加而逐渐下降，表明透明质酸钠自身在水溶液可以发生自聚集，由变化的拐点可以得到其临界聚集浓度为120 μmol/L；图3为在固定透明质酸钠的浓度为0.52 μmol/L的水溶液中（此浓度远低于透明质酸钠的临界聚集浓度，因而透明质酸钠在该浓度下以单体存在，不发生聚集）逐渐加入杯吡啶，体系在350 nm波长处的透光率随杯吡啶浓度变化的实验图，如图3所示，随着杯吡啶的加入，体系在350 nm波长处的透光率先不变，后下降，表明透明质酸钠的存在可以诱导杯吡啶在水溶液中发生聚集，由变化的拐点可以得到在固定透明质酸钠的浓度为0.52 μmol/L时，杯吡啶的临界聚集浓度为31 μmol/L。[0015]（2）图4为在固定杯吡啶的浓度为0.10 mmol/L的水溶液中逐渐加入透明质酸钠，体系在350 nm波长处的透光率随透明质酸钠浓度变化的实验图，如图4所示，随着透明质酸钠的加入，体系在350 nm波长处的透光率先下降，后上升，由变化的拐点可以得到杯吡啶和透明质酸钠在溶液中形成聚集体的最佳混合浓度分别为0.10 mmol/L和1.40 μmol/L。[0016]（3）图5为固定杯吡啶和透明质酸钠的浓度分别为0.10 mmol/L和1.40 μmol/L时，该水溶液在700 nm波长处的透光率随体系pH变化的实验图，如图5所示，随着体系pH值的变化，体系在700 nm波长处的透光率先下降，后上升，由变化的拐点可以得到杯吡啶和透明质酸钠在溶液中形成聚集体的最佳pH值为6。[0017]（二）制备方法
（1）将杯吡啶和透明质酸钠分别溶解于水中，得到杯吡啶溶液和透明质酸钠溶液，将杯吡啶溶液逐滴加入到透明质酸钠溶液中，均匀混合后得到超分子纳米粒子溶液目标物，其中，超分子纳米粒子溶液的pH值为6，杯吡啶和透明质酸钠的浓度分别为0.10 mmol/L和1.40 μmol/L。图6为杯吡啶和透明质酸钠二元超分子组装的纳米粒子的高分辨透射电子显微镜图像；图7为杯吡啶和透明质酸钠二元超分子组装的纳米粒子的扫描电子显微镜图像，如图6、7所示，该超分子纳米粒子的形貌为实心球形，粒径约为70 nm。[0018]（2）图8为固定杯吡啶和透明质酸钠的浓度分别为0.10 mmol/L和1.40 μmol/L时，该水溶液在350 nm波长处的透光率随时间变化的实验图，如图8所示，该体系在350 nm波长处的透光率在长达24小时的时间内随时间都不发生变化，表明该超分子聚集体具有很好的稳定性。[0019]（3）图9为往在最佳条件下构筑的杯吡啶和透明质酸钠超分子纳米粒子体系中加入透明质酸酶后（加入后透明质酸酶的浓度分别为1 U/mL，3 U/mL和10 U/mL），体系在350 nm波长处的透光率随时间变化的实验图，如图9所示，该体系在350 nm波长处的透光率随时间逐渐升高，表明加入透明质酸酶后可以使超分子纳米粒子逐渐解聚，且加入透明质酸酶的浓度越高，体系在350 nm波长处的透光率随时间的变化速率越快，表明加入透明质酸酶的浓度越高，超分子纳米粒子解聚的速度越快。[0020]（4）往在最佳条件下构筑的杯吡啶和透明质酸钠超分子纳米粒子体系中加入透明
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质酸酶21分钟后的高分辨透射电子显微镜图像和扫描电子显微镜图像，如图10、11所示，也证实了超分子纳米粒子的完全解聚。[0021]对比实验：
图12为往在最佳条件下构筑的杯吡啶和透明质酸钠超分子纳米粒子体系中加入透明质酸酶和失活的透明质酸酶后（加入后透明质酸酶和失活的透明质酸酶的浓度均为10 U/mL），控制温度在37℃，体系在350 nm波长处的透光率随时间变化的实验图，如图12所示，加入透明质酸酶后体系在350 nm波长处的透光率随时间逐渐升高，表明加入透明质酸酶后可以使超分子纳米粒子逐渐解聚；而加入失活的透明质酸酶后体系在350 nm波长处的透光率随时间并不升高，表明加入失活的透明质酸酶后并不能使体系中的超分子纳米粒子解聚。[0022]该对比实验表明：透明质酸酶使杯吡啶和透明质酸钠组装的超分子纳米粒子解聚的原因是透明质酸酶的活性导致的降解造成的，失活的透明质酸酶实现不了该解聚。[0023]实施例2
一种上述制备的透明质酸酶调控的超分子纳米粒子在疏水药物模型尼罗红负载和可控释放方面的应用，方法如下：
（1）将尼罗红溶解于无水乙醇中后混合均匀得到溶液，制得尼罗红乙醇液，所述尼罗红的浓度为1.00 mmol/L；将上述尼罗红乙醇液溶解于水中，制得尼罗红水溶液，所述尼罗红的浓度为5.5 μmol/L；将上述尼罗红乙醇液、杯吡啶和透明质酸钠溶解于水中后混合均匀，制得负载尼罗红的超分子纳米粒子，所述尼罗红、杯吡啶和透明质酸钠的浓度分别为5.5 μmol/L、0.10 mmol/L和1.40 μmol/L。图13为尼罗红水溶液中的尼罗红和负载于杯吡啶和透明质酸钠超分子纳米粒子中的尼罗红在550 nm波长处的吸光度随时间变化值（5分钟时的吸光度减去10分钟时的吸光度）的对比图，如图13所示，尼罗红水溶液中的尼罗红在550 nm波长处的吸光度随时间下降很大，表明疏水药物模型尼罗红在水中不稳定，极易析出；而负载于杯吡啶和透明质酸钠超分子纳米粒子中的尼罗红在550 nm波长处的吸光度随时间变化不大，表明疏水药物模型尼罗红稳定负载于杯吡啶和透明质酸钠超分子纳米粒子中。[0024]（2）图14为尼罗红水溶液中的尼罗红和加入透明质酸酶后（加入后透明质酸酶的浓度为10 U/mL）负载于杯吡啶和透明质酸钠超分子纳米粒子中的尼罗红在550 nm波长处的吸光度随时间变化的对比图。如图14所示，尼罗红水溶液中的尼罗红和刚加入透明质酸酶后负载于杯吡啶和透明质酸钠超分子纳米粒子中的尼罗红因为所处的环境不一样，因而在550 nm波长处的吸光度相差很大；随着时间的延长，尼罗红水溶液中的尼罗红和加入透明质酸酶后负载于杯吡啶和透明质酸钠超分子纳米粒子中的尼罗红在550 nm波长处的吸光度相差越来越小，最后趋于一样，表明在透明质酸酶作用下，随着超分子纳米粒子的解聚，负载的疏水药物模型尼罗红被全部释放于水中。
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