大蒜细胞SOD酶的提取分离与活性测定

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大蒜细胞SOD酶的提取分离与

活性测定

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大蒜细胞SOD酶的提取分离与活性测定

目的

1．掌握SOD酶的提取、分离、检测一般步骤。

2．了解酶在提取过程中的两个参数：回收率、纯化倍数。 试剂

大蒜， 磷酸缓冲液（PH7.8, 0.05mol/l)(PH8.3)， 氯仿—乙醇混合液 冷丙酮， 邻苯三酚， 浓盐酸 方法

1．SOD提取：称取5g大蒜蒜瓣,加入石英砂研磨破碎细胞，加入15mlPH7.8、0.05mol/L的磷酸缓冲液，研磨搅拌20分钟，使SOD充分溶解，6000rpm离心，弃去沉淀，得上清液。(留出1ml备用,准确量取剩余上清液体积,记录)

2.除杂蛋白 ：提取液加入1/4体积的氯仿－乙醇混合液搅拌10分钟，6000rpm离心15min去沉淀，得粗酶液。（取1ml粗酶液备用,精确测量剩余粗酶液体积）

3.SOD酶的沉淀分离：剩余的粗酶液中加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，6000rpm离心15min，得到SOD酶沉淀。将沉淀先加2ml磷酸缓冲液，溶解后在加3ml混匀。6000rpm离心15min，取上清得到SOD酶液。取1ml备用，其余量取体积。

2. 大蒜SOD的提取液活性测定

提取液、粗酶液、酶液中SOD活力检测， 1）溶液中可溶性蛋白含量测定：

分别从1ml 备用的提取液、粗酶液、酶液各取0.3ml按以下倍数稀释,260nm/280nm测定吸光值,按公式计算蛋白质浓度.

提取液稀释:50 × 粗酶液稀释:20 ×

酶液稀释:10 ×

蛋白质浓度(mg/ml)=(1.45A280 – 0.74A260) ×稀释倍数 计算

酶活力单位U/ml=2（OD1-OD2）×5/0.1

(1ml反应液中,每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达到80%时的酶量) 总活力U=活力单位×总体积 比活力U/mg=活力单位/蛋白质浓度

纯化倍数=粗酶液(酶液)比活力/提取液比活力 回收率=粗酶液(酶液)总活力/提取液总活力 试验结果记录： 1）

2）蛋白质含量的测定：

3）提取液：酶活力单位U/ml = 4.0 总活力 U = 41.2

蛋白质浓度（mg/ml）= 6.09 比活力 U/mg = 0.6568

粗酶液: 酶活力单位U/ml = 1.3 总活力 U = 12.78

蛋白质浓度（mg/ml）= 3.542 比活力 U/mg = 0.3670 酶液: 酶活力单位U/ml = 6.8 总活力 U = 65.96

蛋白质浓度（mg/ml）= 0.719 比活力 U/mg = 9.4576 4）粗酶液: 纯化倍数 = 0.56

回收率 = 0.31

酶液: 纯化倍数 = 14.40 回收率 = 1.60 实验结果讨论：

粗酶液的实验结果较为正确，操作较为得当，试剂添加较为合理。但是酶液的纯化倍数较大，而且，回收率好像不太正确，值偏大，可能是添加试剂时的量不太准确，或可能与添加了过多的石英砂有关。或者是离心时有部分液体渗出导致引入误差。下次实验应多加注意，小心用量与操作细节与步骤，争取桌做得更好！