浙江中医杂志２０１３年７月第４８卷第７期 【中药研究】 龙葵不同提取物体外抗癌活性部位筛选＊ 陈培丰 高聚伟。 潘磊 １ 浙江省中医院 浙江杭州３１０００６ ， ２ 浙江中医药大学附属第三医院 浙江杭州３１０００７ 提取物 抗癌活性 实验研究 关键词 龙葵龙葵是茄科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）茄属植物龙葵（Ｓｏｌａｎｕｍ ＲＰＭＩ１６４Ｏ培养液终止胰酶消化，轻轻吹打瓶壁细胞， ｎｉｇｒｕｍ Ｌｉｎｎｅ）的全草。临床常用为紫茎龙葵，为１年 至多年生草本植物。性寒、微甘，有小毒。归肺、肾经。 有清热解毒、活血化瘀、利水消肿、止咳祛痰等功效。 近年还发现其有抑癌作用。本研究对龙葵化学成分进 行系统分离提取，并对各提取物进行体外抗癌活性筛 选，以初步确定龙葵抗癌的有效部位。 １材料与方法 １．１ 实验药物：龙葵购自浙江省中医院中药房，产地 为浙江临安，经鉴定为茄科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）茄属（Ｓｏｌａ－ ｎｕｍ）植物龙葵（Ｓｏｌａｎｕｍ ｎｉｇｒｕｍ Ｌ．）的干燥全草。方 法［】 ］：即称取干燥的龙葵饮片５ｋｇ，用８倍量的石油醚 ８Ｏ℃提取２ｈ，提取液除菌１０ｏ℃水浴箱浓缩得浸膏，即 为龙葵石油醚提取物。将其晾干后，依次用氯仿、乙酸 乙酯、正丁醇、水提取，分别得各自提取物，置４℃冰箱 保存备用。精密称取石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇 及水提取物各２０ｒａｇ，溶解于０．５ｍｌ二甲基亚砜（ＤＭ－ ＳＯ）中，旋涡震荡使其全部溶解，其终浓度均为４０ｒａｇ／ ｍｌ，置于一２０℃冰箱保存备用。取石油醚、氯仿、乙酸 乙酯、正丁醇及水提取物的母液各２５ｐ．１，溶解于 ７５／ＡＤＭＳＯ中，旋涡震荡使其全部溶解，加入 ９００￣ＩＲＰＭＩ一１６４０培养液，其终浓度均为ｌｍｇ／ｍｌ，充分 混匀后置于一２０℃冰箱保存备用。 １．２ 细胞与细胞培养 ］：人肝癌ＨｅｐＧ－２、人肺腺癌 Ａ５４９及人宫颈癌ＨｅＬａ细胞，由浙江中医药大学生命科 学学院细胞实验室提供。分别从－－８０ｏＣ低温冰箱中取出 冻存融化，１０００ｒｐｍ／ｍｉｎ，５ｒａｉｎ离心，收集细胞置于２５ｍｌ 的ＨｅｐＧ－２、Ａ５４９及ＨｅＬａ细胞，３７℃水浴中使其快速的 培养瓶，３７℃饱和湿度、５ Ｃ０２的恒温培养箱中培养。 取对数期生长的ＨｅｐＧ一２、Ａ５４９及ＨｅＬａ细胞，弃去旧 培养液，Ｄ—ｈａｎｋ’Ｓ液清洗２遍，加入一定量的胰酶消化 ５ｍｉｎ￣１０ｍｉｎ至细胞皱缩，加入含１Ｏ 新生牛血清的 ＊ 基金项目：浙江省中医药科技计划项目中药龙葵抗肿瘤有 效部位的研究，编号：２００９ＣＡ０１５ 收集于试管中，１０００ｒｐｍ／ｍｉｎ，５ｍｉｎ离心，弃上清，１：２ 传代，继续培养。 １．３ 试剂：ＲＰＭＩ一１６４０：美国ＧＩＢＣＯＢＲＬ公司，批号 １０８３９５６；ＭＴＴ：华美生物工程公司（进口分装），批号 ２０１００６；新生牛血清：杭州四季青生物工程材料研究 所，批号２０１００３２６；１：２５０胰蛋白酶：吉泰科技有限公 司，批号２０１００４；二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）：江苏鸿声化工 厂，批号１１２８７３０。 １．４方法：采用ＭＴＴ法＿４ ］，分别复苏上述３种细胞， 观察细胞生长状态，呈单层贴壁生长，７２ｈ进入对数生 长期后进行细胞传代。传代时用０．１ 胰酶溶液消化， 制成单细胞悬液；调整细胞浓度为３×１Ｏ 个／ｍｌ。接 种细胞悬液入９６孑Ｌ板内，每组３个复孔，２Ｏ０ ｌ／孔，置 ３７℃饱和湿度、５ ９／６ＣＯ。孵箱内培养。实验分组：正常 对照组加入等量的培养液；石油醚提取物、氯仿提取 物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物及水提物，每个样 品均设４个剂量组，分别为２０ｔ￣ｇ、３０ｔ￣ｇ、４０ ｇ及５Ｏ ｇ （即分别加入实验用药２Ｏ １、３０ＩＡ、４０ １和５０￣１），每组３ 个复孔；各组细胞给药４８ｈ后取出９６孑Ｌ板，每孔加入 ＭＴＴ溶液２０￣ｌ（５ｍｇ／ｍ１），震荡混匀后，继续孵育４ｈ。 小心吸去上清液，每孔加入ＤＭＳＯ２００Ｉ￣ｌ，置于微量震 荡器上震荡５ｍｉｎ，使结晶物充分溶解。约１ｈ后，用对 照组调零，酶标仪在５７０ｎｍ波长处测其吸光度值（ＯＤ 值），各个浓度组取其均值，并按下列公式计算细胞增 殖抑制率：细胞增殖抑制率一（１一实验组ＯＤ值／对照 组ＯＤ值）×１ＯＯ 。 ２ 结果 龙葵石油醚提取物、氯仿提取物、乙酸乙酯提取 物、正丁醇提取物及水提物五个部位对ＨｅｐＧ一２、Ａ５４９ 及ＨｅＬａ细胞增殖抑制作用。详见表１～３。 ３’讨论 本实验中，我们以龙葵石油醚提取物、氯仿提取 物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物及水提物５个部位 为实验药物，采用ＭＴＴ法，选用３种与临床应用有较 浙江中医杂志２０１３年７月第４８卷第７期 表１ 龙葵不同提取物对ＨｅｐＧ－２细胞增殖的抑制作用（，ｚ一５） 表３ 龙葵不同提取物对人宫颈癌ＨｅＬａ细胞增殖的抑制作用（ ＝５） 好一致性的肿瘤细胞株进行抑瘤实验，以期得到龙葵 ４ 参考文献 抗癌活性的有效部位，为龙葵的研究开发提供依据。 Ｅｌｉ谢秀琼．中药新制剂开发与应用ＥＭ］．第３版．北京：人民卫 龙葵不同提取物体外抑瘤实验结果表明：经过系 生出版社，１９９４：７０－７１． 统提取分离后，龙葵氯仿和正丁醇提取物对人肝癌 ［２］卢艳花．中药有效成分提取分离技术Ｉ－Ｍ］．第２版．北京：化 ＨｅｐＧ一２细胞、人肺腺癌Ａ５４９细胞及人宫颈癌ＨｅＬａ 学工业出版社，２００８：２－７． 细胞的增殖具有较明显的抑制作用，呈现一定的量效 Ｅ３］司徒镇强，吴正军．细胞培养ＦＭ］．西安：世界图书出版西安 关系，在５０／１ｇ时，对该３种细胞的抑制率分别达到 公司，１９９６：７９—９３． ８３．１ 、７７．２ ，８７．６ 、７８．７ ，８３．８ 、７６．０ 。 Ｅ４］张岱州，李洁，佟全胜．ＭＴＴ法检测白头翁对人肺巨细胞癌 细胞株ＰＧ细胞增殖的抑制作用口］．生物医学工程研究，２０１０， 既往报道认为龙葵的抗癌活性成分为生物碱、龙 ２９（１）：７１—７２． 葵多糖及皂苷类成分 ］。一般认为中药氯仿提取物 Ｅ５］Ｈｕｅｉ—Ｊｕ Ｔｉｎｇ，Ｊｅｆｆｅｒｙ ＨＳＵ，Ｂｏ－Ｙｉｎ Ｂａｏ，ｅｔ ａ１．Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ—ｉｎ— 含有生物碱、苷元等成分；正丁醇提取物含有苷类、水 ｄｕｃｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ａｎｄｒｏｇｅｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ 溶性生物碱等成分；水提物含有多糖等成分。本次实 ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ａｒｅ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｂｙ １ ａ，２５一ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｖｉｔａｍｉｎ Ｄ３ 验结果显示，龙葵氯仿和正丁醇提取物可能是该药抗 ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２４７（１）：１２２—１２９． 肿瘤的有效部位，且氯仿提取物抗癌作用优于正丁醇 Ｅ６］刘为为，刘延庆，戴小军．龙葵抗肿瘤作用的研究进展［Ｊ］．中 提取物，这与上述的研究报道相符合；且龙葵水提取物 药材，２００９，３２（３）：４６２—４６５． 对ＨｅｐＧ一２、Ａ５４９、ＨｅＬａ细胞在体外无明显增殖抑制 ［７］黄华，周建华．龙葵开发研究新进展及应用ＥＪ］．食品工业科 作用，与既往报道有差异，可能与本系统溶剂法未能有 技，２００９，２１３（１）：３１５－３１８． 效提取龙葵的多糖成分，或本次实验用药剂量偏低等 Ｅ８］唐朝辉，张岩，李娜，等．澳洲茄边碱提取纯化工艺及其抗肿 有关。本实验为龙葵抗癌有效成分的筛选及抗癌作用 瘤作用的研究［Ｊ］．中国中药杂志，２０１１，３６（１６）：２１９２—２１９５． 机理的研究提供了初步的实验依据。 收稿日期 ２０１３—０２—０４