PCR之模板

PCR之模板——大豆基因组DNA的提取

一 实验目的：通过本实验学习基因组提取的方法。

二 实验器材

器材：离心管、移液枪、研钵、恒温水浴锅、冷冻高速离心机

材料：大豆（去皮，在低温下研钵）

试剂：CTAB提取液（2%CTAB、1.4mol/L、100mol/L Tris-HCl pH8.0、20mmol/L EDTA pH8.0）

酚一氯仿一异戊醇（25:24:1，V/V）

CTAB/NaCl （10% CTAB， 0.7mol/L NaCl）

高盐TE缓冲液（100mol/L Tris-HCl pH8.0，0.1 mmol/L EDTA pH8.0, 1mol/L NaCl）

异丙醇（与-20度下保存）70%乙醇

TE缓冲液（10mol/L Tris-HC，1 mmol/L EDTA pH8.0）

RNA酶（10mg/ml）

琼脂糖浓度（1.2%） EB浓度（5ml/100ml TBE）

三 实验步骤

（一）

1) 称大豆0.1g于离心管中

2) 加入500ml 65度预热的CTAB提取液（其间不时温和摇匀），65度孵育40min

3) 1600r/min离心10min

4) 取上清液，先加入1/6倍体积的预热的CTAB/NaCl 溶液，再加入等上清液体积的酚—氯仿—异戊醇，温和混匀

5) 1600r/min离心10min

6) 取上清液，重复上述4)步骤

7) 取上清液，加2倍体积CTAB沉淀液，65度温育30min

8) 1600r/min离心10min

9) 取沉淀，加入500ml高盐TE 缓冲液，65度温育等沉淀溶解

10) 加入0.6倍体积预冷的异丙醇

11) 1600r/min离心10min

12) 70%乙醇洗涤沉淀，温室干燥

13) 50molTE缓冲液溶解DNA

14) 1ul RNA 酶，37度温育15min，冰箱保存

（二）PCR操作（在冰上操作）

于0.2mlPCR管按下列顺序加样

ddH2O 17.3uL ①

10xBuffer 2.5 uL ②

25mmol/L MgCl2 1.5 uL ③

10mmol/L dNTP 0.5 uL ④

10um上游引物 1 uL ⑤

10um下游引物 1 uL ⑥

DNA Tag 聚合酶 0.2uL ⑦

将反应液混匀，就、再加入1uL 模板DNA ，将PCR管放入PCR热循环仪中，按下列顺序开始循环：94度 4min，94度30’,60度 30’,72度 2’（后面三个 35个循环） 72度 7’.

（三）PCR产物的检测

1.制胶

a. 称取1.8g琼脂糖，加入150ml的TBE缓冲液，摇匀，用电子天平称三角烧瓶的总质量。

b. 电炉上加热，至琼脂糖完全溶解，然后在天平上加蒸馏水至原质量。

c. 用凝胶将制板两端封好，插入适当的梳子，将溶解的琼脂糖倒入其中，直至厚度4-6mm，在室温下冷却凝固。

d. 将制胶板置于电泳槽中，小心垂直向上拔出梳子，以保证点样孔完好。

2.点样

a. 将2.0 uL 溴酚蓝加入到PCR产物中，然后稍微离心。

b. 每孔点样10.0 uL蓝色样品混合物将沉入点样孔下部。

3.电泳：打开电源开关，调节电压至3-5V/cm（约100V），可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，约1小时后即可观察。

4.染色：将电泳好的凝胶放入含EB的谁溶液中染色15-20min

5.观察：将电泳好的胶置于紫外透射检测仪上，戴上防护观察罩，打开紫外灯，可见到橙色核酸条带，根据条大赛粗细，可粗略估计该样品DNA的浓度，如同时有已知分子量的标准DNA进行电泳，可通过线性DNA条带的先对位置初步估计样品的分子量。

四 思考题

1. DNA纯度用什么来指示？

2. PCR反应液中主要成分是哪些？在PCR反应过程中各起什么作用？

3. 为什么在PCR反应过程中，使用三个不同的温度变化？

4. 用PCR扩增目的基因，要想得到特异性产物需注意哪些事项？