第一章 概述
第一节 酶制剂的定义 一、 酶制剂的定义
从生物 (包括动物、植物、微生物〕中提取的具有生物催化能力的酶，辅以其他成分，用于加速加工过程和提高产品质量的制品，称为酶制剂。 二、 酶制剂的分类 1.从形态上分类
从形态上可以将酶制剂分为固体酶制剂和液体酶制剂。 2.按酶制剂在应用领域上的分类
按酶制剂的应用领域可以分为:用于工业生产上作为催化剂的工业酶制剂，如-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、葡萄糖异构酶、青霉素酰化酶、天冬氨酸酶、富马酸酶等; 2.按酶制剂在应用领域上的分类
用于饲料中提高动物消化率的酶制剂，又称饲料酶制剂; 用于食品生产加工的酶制剂，又称为食品酶制剂; 用于临床检测的诊断酶制剂; 用于化学分析的酶分析制剂; 用作药物的药物酶制剂;
用于洗涤剂的洗涤酶制剂等。 3.按酶的来源不同分类
按酶的来源不同，可将酶制剂分为植物酶制剂、动物酶制剂和微生物酶制剂。 4.按酶生产加工方法的不同分类
针对应用的需要，可将酶分为游离酶制剂、固定化酶制剂、酶试纸、酶电极等。 5.按酶的组成成分分类
根据酶制剂中所含酶种类的多少可分为单一酶制剂 (只含有一种酶，如淀粉)和复合酶制剂。
复合酶制剂由一种或几种单一酶制剂为主体，加上其他单一酶制剂混合而成，或由一种或几种微生物发酵获得。复合酶制剂可利用各种酶的协同作用，降解各种底物，最大限度地到达酶制剂的作用。 6.按酶的含量分类
根据酶制剂中酶的浓度，可将酶分为普通酶和浓缩酶。普通酶具有价格低、效果好等优点。浓缩酶颜色较深，具有本钱较低、用量少的特点。
第二节 酶分析
一、反响速率用来测定催化活性
酶作为生物催化剂，提高了反响的速率或允许该反响进展。因此，可以检测底物的转化率υ来确定酶的催化活性。
酶动力学的各个方程中，底物的浓度保持在一个远远高于米氏常数的水平上，这样，所有的酶都被底物所饱和，反响以恒速即最大速率进展。因此，酶的催化活性与所用的酶量线性相关。在酶的活性的测定中，往往要设法到达这一条件。 二、单位定义
酶活单位最初是由第一个发现酶并对酶进展描述的研究者来定义的。因此在一些较早的文献中，酶的活性以任意各种形式来表示，如吸光度的变化、复原基团的增加，以mg或µg表示的被转化底物的数量。这些参数和各种时间单位，如1min、30min或1h。
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1961年，世界生物化学协会酶学委员会用国际单位U来定义酶的活性，定义为在优化的标准条件下，1U即每分钟催化1mol的底物的量。 有关酶根本的国际单位〔SI〕，世界临床化学家协会数量和单位专家小组以及国际理论和应用化学联合会临床化学数量和单位委员会定义了一个根本单位，katal，定义为测定体系中，每秒钟催化1mol的转化反响速率所需要的酶的数量，但这个单位并不常用。
每一次测定中必须标明温度。通常，在0～40℃围，温度每提高10℃酶催化反响的速率会变为2倍。而为获得可重复性的结果，必须准确控制温度，并保持其恒定。 但由于许多实际的原因，对于许多酶反响的监控并不能够通过消耗的底物或生成的产物的化学计量来实现。因此，对于某一特定的酶，它的催化活性也许根本不能用国际单位来表示。
在分子生物学中，大局部的酶的单位定义相当随意。例如，限制性切酶〔E.C.3.1.21.3-5〕的酶活定义为：在一定的温育条件下，酶使DNA某一特定键断裂，在电泳后可以检测到的准确数量〔通常1g〕的DNA时酶的催化活性。
还有其他一些定义这些酶活的参数，如以微克、纳摩尔、吸光度单位或者是碱基对的数目来表示的核酸降解以及核苷在核酸分子中的结合，由于一些实际的原因，不同的时间周期如1min、10min 、30min或60min被选作参考。 三、吸光度法
根本的考虑因素。由于吸光度法技术上简单可靠，所用仪器价格合理，因此是目前酶活测定中首选的方法之一。
当底物或产物是有颜色的，或者是在紫外区有光吸收的，吸光度法就可以非常快速和方便地进展，因为吸光产物的出现速率或者消失速率可以用分光光度法来跟踪检测。 催化活性z对应于每分钟的吸光度的变化为： z=〔△AV×100〕/εd△t
式中，V是测量体积，L;t是时间，min；z的单位是mol/min，对英语前面章节里给出的国际单位制U的定义。
四、荧光光度法
荧光光度计的方法很少用于粗酶或者是纯酶制备中催化活性的检测。由于它具有很高的灵敏度，可以用于器官或者组织区域的微量酶的测定。 总体上，这种方法的灵敏度是吸光光度法的1000多倍。
五、发光法测定 发光法应用荧光、磷光以及化学发光等作为检测器体系。活的生物体中观察的化学放光称作生物体发光。生物体发光是由成为荧光素酶的酶类催化产生的，这类酶的底物即虫荧光素，被转化为发光产物。在发光法中，单位时间反响体系发射的光子数目可以由特殊设计的仪器——照度计来测量，这类仪器是以单光子探测器为根底的，通常是光电倍增管。
由来源于萤火虫的荧光素酶催化的反响就是一个例子，萤火虫荧光素4-单加氧酶〔ATP水解酶〕
ATP+D-虫荧光素+O2→氧合虫荧光素+AMP+pp+CO2+0.9hν
在该反响中，ATP作为底物被消耗掉，光子在562nm的波长处发射。每摩尔的虫荧光素的量子产量是0.9爱因斯坦，也即消耗掉一分子ATP，大约发射1个光子。因此该反响适合用来测定ATP，从而测定那些能够催化ATP消耗或者是ATP生产的反响的那些酶。
为借助于萤火虫的生物发光来检测酶的活性，光强度必须在几分钟呈线性增加，而且必须严格正比于酶的催化活性。这些测定条件在测定肌酸激酶的催化活性时，已经得到了实现。 磷酸肌酸+ADP→肌氨酸+ATP
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其他依赖于NAD〔P〕的反响可以通过来源于发光细菌的生物发光来跟踪检测。 六、辐射线测定
当使用一些放射性标记的底物时，一些酶的活性就可以得到高灵敏度的测定了。这种技术广泛应用于分子生物学领域以检测：
〔1〕放射性标记的核苷结合入不溶于酸的核苷酸或者多核苷酸〔DNA或RNA聚合酶〕； 〔2〕放射性标记的DNA的分解〔核酸外切酶Ⅲ〕；
〔3〕放射性标记的磷酸基团从-32P-ATP到多核苷酸的5-羟基端〔多核苷酸激酶〕的转移； 〔4〕载体基质上放射性标记的焦磷酸盐之间的交换〔T4DNA连接酶〕。标记最常用的同位素是32P,14C，3H，用的较少的是35S。
七、电位测定法
pH敏感的玻璃电极可以用于测定那些产生或消耗质子的反响。出于这个目的，利用反滴定法保持pH的恒定，所需要的酸或碱的消耗量就可以被测定。电极控制着自动滴定器，这个概念就是BUCHER描述的pH-stat技术。
一个典型的例子是脂肪酶〔E.C.3.1.1.3〕[9001-62-1]催化活性的测定。某脂〔甘油三酯〕被该酶水解，生产的脂肪酸被NaOH在pH-stat的模式下反滴定中和。 甘油三酯+H2O→甘油二酯+脂肪酸
橄榄油作为底物，和含有脂肪酶的稀释样品溶液混合温育，混合物在恒定pH下滴定。纪录器标绘出了NaOH的消耗量随时间的变化曲线，所得到的斜率与酶的催化活性相关。其他的例子如木瓜蛋白酶〔E.C.3.4.22.2〕[9001-73-4]的测定和葡萄糖氧化酶〔glucose oxidase, E.C.1.1.3.4〕[9001-37-0]的测定。
八、电导测定法 原那么上，所有酶的反响只要能够引起总离子流动性的变化，就能够通过电导测定法来测定。这样，使用未修饰的弹性蛋白作为底物，胰肽酶〔elastase，E.C.3.4.21.36〕的胰肽水解活性已得到了测定。其他的一些应用也有报道。反响中肽键的断裂导致质子的释放。
九、量热法
许多酶反响会放出热，因此引起人们对量热〔量焓的〕法的兴趣。在适宜的实验安排下，温度传感器用作测定酶催化活性的装置。根据这种方法，分析化学出现了一个新的领域。以前称为微量热法，现在大家所熟知的称为热焓测量法。这种方法主要应用于研究领域。
十、旋光测定法
旋光测定法很少被使用，一定程度上是因为其不方便性。但是在测定变旋酶〔mutarotase，E.C.5.1.3.3〕[9031-76-9]的催化活性时确是必需的，该酶催化-葡萄糖和-葡萄糖之间的转化平衡。
十一、测压法
测压法是生物化学中的经典方法之一，它不再用于酶的常规测定。以前，葡萄糖氧化酶〔glucose oxidase〕和精氨酸酶〔arginase, E.C.3.5.3.1〕[9000-96-8]以及其他的一些酶是用这种方法测定的。
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十二、黏度测定法
黏度测定法在酶活检测中在实际上已经被摒弃了。例如，以前纤维素酶〔cellulase，E.C.3.2.1.4〕[9012-54-8]的活性是通过单位时间黏度的变化来测定的。现在纤维素酶的测得是通过显色法反响来测定。
纤维素→低聚糖+n葡萄糖→红色染料
十三、比浊法
浊度法能够拥有不同酶的测定。例如，用溶菌酶[胞壁质酶〔muramidase〕，E.C.3.2.1.17]裂解细菌细胞壁。使用标准的底物悬浮液〔藤黄微球菌〔Micrococcus luteus〕的干芽孢〕，25℃在450nm处测定吸光度的降低。
十四、固定化酶
固定化酶用于在分析化学中，并在化学品、医药品以及食品的生产中用作催化剂，它们还可以作为研究结合酶的简单明确的模型。 由于固定化酶的特殊构造，需要采用专门的测定法。除了需要不同于可溶酶的最正确条件外，孔径、孔径分布、机械和化学构造、基质的稳定性和构造异界用作固定化酶的催化活性等等，都必须考虑到。
对于不可溶酶至少有两种不同的测定步骤：一个是在容器中搅拌悬浮，另一个是利用填充床和柱反响器。这样的测定条件非常接近于工业应用中所使用的条件。酶的活性检测可以连续或者是分批测定。 电导分析法，电势测定法以及旋光测定法比光度测定法更适合用于检测，因为那些测定方法可以使反响能够被连续跟踪检测，而不需要添加另外的指示酶、辅酶或者第二个底物。一个例子就是固定化青霉素酰胺酶〔penicillin amidase, E.C.3.5.1.11〕[9014-06-6]的测定。 青霉素G+H2O →6-氨基青霉素+乙酸苯酯+H+
十五、电泳
对于测定核酸酶，尤其是限制性切酶的催化活性，电泳是必不可少的一个工具。它也用于其他一些基因工程中重要的酶，如DNA甲基化酶。限制性酶催化DNA的特异性切割，如大肠杆菌〔Escherichia coli〕的噬菌体λDNA的切割，该DNA是基因工程中一个典型的底物。该DNA被切割成一些确定长度的小片段。对于所有的DNA片段，每个碱基对所带的负电荷是一样的，因此根据片段的长度来别离。
对于每一个特异的酶-底物反响，仔细地优化条件，就可以通过电影将切割产物完整地的或不完全切割的分子相别离。
电泳通常使用高质量的琼脂糖凝胶作为载体材料。对于每一个分辨率问题，都需要一个特定的琼脂糖浓度，如对于大片段，采用相对较低的琼脂糖浓度〔每100mL0.5g〕，对于小片段，那么采用相对高一些的琼脂糖浓度〔每100mL 1.62g〕。
当必须要别离很小的片段时，那么可以用聚丙烯酰胺作为替代的载体材料。别离的DNA片段可以通过瑛姑染料溴化乙锭染色来进展观察。在电泳后，将胶片至于一个单独的容器中染色，用来标记DNA片段，或更容易的做法，胶片染色后直接在胶和缓冲液中〔如1g/ml〕
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进展电泳，将DNA片段进展标记。
当胶片在长波长〔如366nm〕的紫外灯照射下，别离的DNA片段就变得可见并可以拍摄图片了。
例如，限制性酶HindⅢ的电泳检测简单描述如下，见图10。
〔1〕单位定义 在0.025mL体积，完全切割1gλDNA的HindⅢ催化活性为一个单位。反响在0.025mL的一定缓冲液混合物中进展，37℃温育60min后完毕。
〔2〕测定 不同体积〔13L〕的几种稀释倍数〔1:10,1:20,1：:30〕的酶液与1gλDNA一起温育，总体积均为0.025mL。60min后，将反响混合物放在冰上冷却，并参加0.015mL的终止液终止反响；然后将反响的混合物〔0.02mL〕放置于琼脂糖凝胶的泳道中。
〔3〕琼脂糖凝胶该胶是由1g/100mL 琼脂糖和1mg/mL的溴化乙锭组成。胶的尺寸是〔200×200〕mm2；总体积250mL；并用梳子制备〔1×7〕mm2的泳道。 〔4〕电泳：仪器设置为液面下电泳〔100V，2h〕。缓冲液体系是三-〔羟甲基〕氨基甲烷乙酸[tris(hydroxymethyl) aminomethane-acetate],40mmol/L,乙二胺四乙酸钠〔disodium ethylenediamine-tetraacetate，EDTA〕，2mmol/L；pH8.2.。缓冲液中含有1mg/mL溴化乙锭。 〔5〕检测 电泳完毕后，凝胶直接用长波长的紫外灯〔366nm〕照射并拍摄〔人造偏光板CU5/薄膜类型107〕；在胶上对应完全特征的DNA片段处估算酶量[如图10中泳道c]。催化活性计算如下。
原始酶液的活性：
活性=〔稀释倍数/样品体积，mL〕×(单位/体积，mL) 在上面的例子中，原始酶液以1:30稀释后，实现完全切割所需要的最小体积为0.003mL，因而计算其活性为10000U/mL。
第三节 酶制剂的质量评估
一、质量指标
酶制剂的质量是由其活性、纯度、稳定性、配方和包装来表征。这些参数互相影响，但是配方和包装很容易控制并保持恒定。其他的参数互相影响，因而质量被认为是活性、纯度和稳定性的函数。
二、 比活
酶制剂一个最重要的质量指标是其比活，也即与其蛋白含量相关的催化活性。比活单位通常表示为，U/mg(单位每毫克)，或者对于不够纯的产物，U/g〔单位每克〕 只有当酶的比活能够和其同一来源的高纯度酶相比较时才能够准确的求取。因此，酶活性测定必须在完全一样的条件下测定，包括蛋白质量的测定。
三、蛋白质测定
蛋白质含量是酶制剂的比活测定中的最重要参考，下面的几个段落中简单介绍了几种蛋白质含量测定方法。所有的这些方法基于不同原理，并取决于酶蛋白的氨基酸组成。因此，不同的方法会得到不同的数值。 〔1〕紫外吸收 〔2〕缩二脲法 〔3〕BCA法
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〔4〕Lowry法
〔5〕蛋白质-染料的结合 〔6〕Kjeldahl分析法
四、污染活性
污染活性，也就是原料酶中含有的其他酶量，是酶的一个非常重要的质量指标。这通常和主体酶的活性有关，并以百分数的形式表示。由于它的绝对值通常很小，不能用蛋白量〔毫克〕来表示，因此并不影响酶制剂的总比活。
五、电泳纯度
电泳由于其高的灵敏度〔能检测出50 g/mL的污染蛋白〕，在酶的纯度评估中非常重要。该方法对于测定污染活性而言并不占有优势，而且丧失了酶活的蛋白质通常并不影响酶的分析。电泳在分析同工酶时就突显出了其重要性，因为同工酶不能通过其催化作用而分开，只能通过其物理性质如电荷，才能分开。对于确认同工酶中的乳酸脱氢酶而言，电泳是一个必不可少的工具。
六、高压液相色谱
自从20世纪80年代以来，该方法在蛋白质方面使用已经非常普及了。通过峰图评估，高效液相色谱测定法用来测定酶的纯度或者获得相关同工酶的信息。如过氧化物酶〔peroxidase，E.C.1.11.1.7〕，碱性磷酸酶〔alkaline phosphatase，E.C.3.1.3.1〕以及过氧化氢酶〔catalase，，E.C.1.1.1.6〕。 七、性能测试
对于许多应用场合，如果酶制剂不含有任何有干扰的污染活性，就可以使用局部纯化的酶制剂，因为相对于高纯的产品而言其价格廉价。但是，举个例子，它们也许含有未知的副产物，会干扰酶的分析。为防止这些问题，应该进展性能测试。如用葡萄糖氧化酶〔glucose oxidase〕和过氧化氢酶〔peroxidase，E.C.1.11.1.7〕来检测葡萄糖，或者用甘油激酶〔glycerokinase，E.C.2.7.1.30〕来测定甘油。
八、氨基酸分析和蛋白质序列分析
这两种方法通常都被用来估算酶的数量以及确定它们的组成。对于氨基酸分析，蛋白质首先被完全水解〔化学法或者酶法〕，释放的氨基酸通过定量色谱来测定。氨基酸需要衍生化来改善其色谱性能或可检测性。尽管这种方法很费力，但是经常使用。 九、稳定性
酶应用中一个重要的因素就是，浓缩或稀释的酶液在和别的物质混合时的稳定性。酶的稳定性应用于医药产品的生产、食品化学以及酶的分析中。一些酶可以通过其水溶液中参加甘油〔50vol%〕、硫酸铵〔大约3.2mol/L〕或者氯化钠〔3mol/L〕来保持其稳定性。此外，许多酶可以在如盐、防腐剂、惰性蛋白〔主要是牛血清蛋白〕或碳水化合物等稳定剂存在的条件下，以冷冻枯燥的形式保持很长的一段时间。
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十一、酶制剂的剂型
酶制剂应该根据它的应用而采用不同的剂型。如果用于分析，应该容易用移液管吸取，而且最好没有添加稳定剂和防腐剂，因为它们会消弱酶的活性。例如，如果用谷氨酸脱氢酶〔glutamate dehydrogenase，E.C.1.4.1.3〕[9029-12-3]来测定尿素或者是铵，应该不能含有任何痕量的氮。
.包装 仔细地选择包装材料对于酶的操作也是非常重要的。用于保存冷冻枯燥的酶所用的瓶子和塞子必须绝对严密以防止湿气侵入。玻璃和塑料瓶子也和塞子〔橡胶的或塑料的〕一样，绝对不能让一丝痕量的重金属和其他使酶失活的物质泄漏进入酶溶液或悬浮液中。有些情况下，酶必须避光保存，包装在棕色的玻璃瓶。
第二章 粗酶制剂的生产技术 第一节 提取别离法产酶技术
提取别离法产酶技术主要包括细胞破碎、酶的提取、酶的粗别离和酶的精制等技术环节，其中酶的精制在第三章中介绍。 一、细胞破碎 〔一〕机械破碎法 1、捣碎法 2、珠磨法
3、匀浆法 〔二〕物理破碎法 1、超声波破碎法 2、冻融法 〔三〕化学破碎法
1、有机溶剂渗透法 2、外表活性剂渗透法 〔四〕 酶溶法 二、酶的抽提
酶的抽提是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程，也称为酶的提取。该过程实际上经常是在细胞破碎时已经同时进展。 〔一〕抽提方法
1、稀盐法：0.020.5mol/L 2、稀酸法: pH不能太低； 3、稀碱法：pH不能太高； 4、有机溶剂法：适用结合酶； 5、双水相萃取法： 〔二〕提取条件的控制 1、温度 2、pH 3、盐浓度 4、杂菌
三、酶的粗别离
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〔一〕 沉淀别离 1、盐析沉淀法 2、有机溶剂沉淀法 3、等电点沉淀法 4、有机聚合物沉淀法 5、选择性变性沉淀法
〔二〕 粗滤别离 1、常压过滤 2、加压过滤
3、减压过滤：真空过滤或抽滤 〔三〕 离心别离 1、差速离心法 2、密度梯度离心法 3、等密度梯度离心法
第二节 微生物发酵法产酶技术
一、产酶微生物及其保藏 〔一〕 常用产酶微生物 〔二〕菌种的保藏 1、斜面冰箱保藏法 2、沙土管保藏法 3、石蜡油保藏法
4、真空枯燥冷冻保藏法 5、液氮超低温保藏法
〔二〕发酵培养基的配制 1、培养基的根本组分 2、培养基配制实例 〔三)发酵方式
固体发酵、液体深层发酵和固定化细胞发酵 1、固体发酵法 2、液体深层发酵法 3、固定化细胞发酵法
固定化细胞又称为固定化活细胞或固定化增殖细胞，是指采用各种方法固定在载体上，在一定空间围进展生长、繁殖和新代的细胞。
固定化细胞发酵产酶与游离细胞发酵产酶相比，具有以下特点: ①细胞密度大，可提高产酶能力；
②发酵稳定性好，可以反复使用或连续使用较长时间； ③细胞固定在载体上，有利于连续化、自动化生产；
④发酵液中含菌体较少，利于产品别离纯化，提高产品质量等。
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和游离细胞发酵产酶相比，固定化细胞发酵在以下几个方面应加以注意： ⑴固定化细胞预培养； ⑵溶解氧的供给； ⑶温度的控制； ⑷培养基的控制。
〔四〕发酵条件的控制 1、pH 2、温度 3、溶解氧
三、提高产酶的措施 1、添加诱导物：
诱导物一般分为三类：酶的作用底物、酶的反响物和酶的底物类似物。 2、控制遏制物浓度
3、添加外表活性剂：非离子型外表活性剂 4、添加产酶促进剂
第三节 酶的浓缩、枯燥与保藏
经过发酵或细胞破碎、抽提等操作，所得发酵液或提取液中酶蛋白浓度很低，如发酵液中酶蛋白浓度一般为0.1%～1%，需进一步浓缩、枯燥，制备成一定形态的酶制剂，以便使用、运输和保藏。浓缩与枯燥是使酶与溶剂〔通常是水〕别离的技术过程，在酶制剂的制备过程中是一个重要的环节。 一、酶的浓缩 1、蒸发浓缩法 2、离子交换浓缩法 3、吸水浓缩法
〔1〕用葡聚糖凝胶〔分子筛〕浓缩： 〔2〕用聚乙二醇浓缩： 二、酶的枯燥
枯燥是将固体、半固体或浓缩液中的水分〔或其他溶剂〕除去一局部，以获得含水较少的固体的过程。其目的主要是提高产品的稳定性，使之易于保存、运输和使用。枯燥通常是生物产物成品化前的最后加工过程。因此，加工的质量直接影响产品的质量和价值。 酶枯燥的方法很多，根据酶在高温、枯燥条件下容易失活变性的特点，常用的枯燥方法有以下几种： 1、真空枯燥 2、冷冻枯燥 3、喷雾枯燥 4、气流枯燥 5、吸附枯燥
三、酶制剂的保藏
要使酶制剂较长时间保持活性和稳定性，必须根据酶的特性，采取适宜的保存条件。下面介绍酶制剂保存的主要条件。 1、维持适宜的温度
酶保存的温度一般为04℃，少量精制的纯酶常在-20 ℃冰箱中保存，甚至在-80 ℃或
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液氮中保存，冷冻枯燥保存酶更好。 2、维持适宜的pH
3、进展抗氧化保护：二硫糖醇、二巯基乙醇、复原型谷胱甘肽 4、提高酶的浓度和纯度
一般地说，酶的浓度越高，杂蛋白越少，酶越稳定；低浓度时酶易于解离、吸附或发生外表变性失效。将酶制备成晶体或干粉更有利于保存。
此外，还可通过参加酶的各种稳定剂来加强酶稳定性，延长酶的保存时间。
第三章 酶的精制技术
酶的精制也叫精细纯化是指将酶与杂质进一步别离，使之到达较高纯度的技术过程。 第一节 酶的膜别离技术
膜别离技术是指借助一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不同形状和不同特性的多组分的溶质或溶剂进展别离或浓缩的技术。
膜别离技术根据过程推动力的不同，大体可分为两类。一类是以压力为推动力的过程，如微滤(孔径为0.1～10 m)、超滤(0.001～0.1 m)和反渗透(0.0001～0.001 m)分别需至0.05～0.5MPa、01～1.0MPa、1.0～10MPa的操作压力(压差)：另一类足以电化学相互作用为推动力的膜过程，如电渗透、透析。在酶的精细纯化过程中，应用最多的是透析与超滤技术。 一、透析
〔一〕透析原理
透析是利用半透膜两侧溶质浓度差为传质推动力和小分子物质的扩散作用，从溶液中别离出小分子物质而截留大分子物质的过程。 〔二〕透析膜
可以充当透析膜的材料很多，如禽类的嗉囊、兽类的膀胱、羊皮纸、玻璃纸〔赛璐珞〕、硝化纤维等。人工制作透析膜多以纤维素的衍生物作为材料。 〔三〕透析操作
透析操作时，透析袋一端用橡皮筋或线绳扎紧，也可以使用特制的透析袋夹夹紧，由另一端灌的满水，用手指稍加压，检查不漏，方可装入待透析液，通常要留1/3～1/2空间，以防透析过程中，透析的小分子量较大时，袋外的水和缓冲液过量进入袋将袋涨破。 二、超滤
〔一〕超滤原理
超滤是最常用的膜别离技术，利用有选择通透性的微孔膜，在液压作用下，小溶质分子随溶剂透过膜转移到膜的另一侧，而大溶质分子〔酶〕那么被截留下来，因此大小溶质分子得以别离。
超滤是借助超滤膜对溶质在分子水平上进展物理筛分的别离技术。超滤时的操作压力一般控制在0.050.7Mpa，压力可由压缩气体或压力泵来维持。 〔二〕超滤膜组件
在工业化规模生产中，膜过滤装置由膜组件构成。由膜、固定膜的支撑体、间隔物以及收纳这些部件的容器构成的一个单元称为膜组件或膜装置。膜组件的构造根据膜的形式而异，目前，市售商品膜组件主要有管式、平板式、螺旋卷式和中空纤维〔毛细管〕式四种，其中管式和中空纤维式膜组件根据操作方式不同，又分为压式和外压式。图3-3为主要膜组件的构造示意图。四种膜组件的性能如表3-1所示。
目前，在超滤中常用的是离心泵和旋涡泵，对某些具有生理活性的物质的超滤别离，为
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了防止叶轮高速旋转所造成的失活常选用蠕动泵。
(三)超滤装置
(1) 搅拌式超滤器。搅拌式超滤器装磁力搅拌器〔图3-4〕，用以加速膜面大分子的扩散作用，保持流速。单位时间透过液体量与有效膜面积成正比，工作压力为303.95065kPa。它适合于实验室处理少量浓度稀的酶液。
〔2〕小棒超滤器。棒心为多孔高聚物支持物，外裹各种规格的超滤膜，使用时将其插入待别离液中，开动连接的真空系统即进展超滤，它适合于处理少量浓度稀的大分子样液，一次可以同时处理多个样品。小棒超滤器装置见图3-5
〔3〕浅道系统超滤装置。这类超滤器使液体通过螺旋形浅道，向与膜平行的方向流动。浅道底部有膜，由于液体在超滤膜外表高速流动，浓度差极化不显著。而且液体与膜的接触面积也大于一般搅拌型装置，故有很好的滤速。浅道系统超滤装置见图3-6
〔4〕中空纤维式超滤器。该超滤器的过滤介质是具有与超滤膜类似构造的中空纤维丝，每根纤维丝即为一个微型管状超滤器。中空纤维丝很细，它能承受很高压力而不需任何支撑物，使得设备构造大大简化。中空纤维的径一般为0.2mm，外表积与体积的比率极大，所以滤速很高，适用于大规模生产操作。中空纤维系统超滤器分外流型和流型两种〔图3-7〕。
超滤系统可以采用间歇操作或连续操作(图3-8)。连续操作的优点是产品在系统中停留时间短，这对热敏或剪切力敏感的产品是有利的，主要用于大规模生产。它的主要缺点是在较高的浓度下操作，故通量较低。间歇操作平均通量较高，所需膜面积较小，装置简单，本钱也较低，但需要较大的储槽。
(四)膜的污染与清洗
超滤器的使用性能除了与其工艺参数有关外，还与膜的污染程度有关。膜在使用过程中，尽管操作条件保持不变，但通量仍逐渐降低的现象称为膜污染。膜污染的主至原因是颗粒堵塞和膜外表的物理吸附造成。膜的污染被认为是超滤过程中最主要的障碍。 1．减轻膜污染的方法
(1)预处理。将料液经过滤器进展预过滤，以除去较大的粒子，特别对中空纤维和螺旋卷绕式超滤器尤为重要。蛋白质吸附在膜外表上常是形成污染的原因，调节料液的pH远离等电点可使吸附作用减弱，但如果吸附是由于静电引力，那么应调节至等电点。另外，盐类对污染也有很大影响，pH高时，盐类易沉淀；pH低时，盐类沉淀较少。参加络合剂如EDTA等可防止Ca2+等沉淀。
(2)改变膜的外表性质。在膜制备时，改变膜的外表极性扣电荷，常可减轻污染。可以将膜先用吸附力较强的溶质吸附，那么膜就不会两吸附蛋白质，如聚矾膜可用大豆卵磷脂的酒精溶液预先处理，醋酸纤维膜用阳离子外表活性剂处理，可防止污染。 2．膜的清洗方法
超滤运转一段时间以后，必须对膜进展清洗，除去膜外表聚集物，以恢复其透过性。对膜清洗可用物理法、化学法，或两者结合起来使用。
(1)物理方法(机械方法) 是借助于液体流动所产生的机械力将膜面上的污染物冲刷掉。通过加海绵球、增大流速、逆流(对中空纤维超滤器)、脉冲流动和使用超声波等方法，可以使膜得以清洗。
(2)化学方法。物理清洗往往不能把膜面彻底洗净，这时可根据体系的情况适当加—些化学药剂进展化学清洗。
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①使用起溶解作用的物质：如酸、碱、酶(蛋白酶)、螯合剂和外表活性剂等； ②使用起氧化作用的物质：如过氧化氢、次氯酸盐等 ③使用起渗透作用的物质：如磷酸盐、聚磷酸盐等。
膜清洗后，如暂时不用，可将其贮存在清水中，并加少量甲醛以防止细菌的生长。
第二节 酶的层析别离技术
层析别离(也叫色谱别离)是利用混合物中各组分的物理化学性质(分子的大小、形状、分子极性、吸附力 、分子亲和力和分配系数等)的不同使各组分在两相(固定相与流动相)中的分布程度不同而使各组分得以别离的方法。
常用的方法有离子交换层析、凝胶层析、亲和层析、疏水层析等。实际应用时，要根据酶的不同特性选用适宜的层析方法，或用几种层析方法配合进展酶的别离纯化。 一、离子交换层析 〔一〕根本原理
离子交换层析是利用离子交换剂上的可解离基团对各种离子的亲和力不同，而使溶液中不同溶质得以别离的方法。
离于交换剂具有酸件或碱性基团，能分别与水溶液中的阳离子或阴离子进展交换，分别称为阳离子交换剂和阴离子交换剂。 离子交换的过程可分为五个步骤：
(1)离子向交换剂颗粒外表扩散。在均一的溶液中，这个过程进展得很快。
(2)离子在交换剂颗粒部向它的带电局部扩散。扩散的速度取决于交换剂的交联度和溶液的浓度。这一步是整个离子交换过程中限速的一步。
(3)离子在交换剂的带电局部进展交换。这一步能瞬间发生且呈平衡关系。如果是阳离子交换剂，
(4)被交换的离子通过交换剂扩散到外表。
(5)用洗脱液脱附，被交换的离子扩散到周围的溶液中。 (二)离于交换剂的种类
离子交换剂的种类很多。根据可供交换的离子的性质，可分为阳离子型和阴离子型。 可以和阴离子交换的交换剂称为阴离子交换剂；可以和阳离子进展交换的交换剂称为阳离子交换剂。按酸碱性的强弱，离子交换剂又可分强酸、弱酸型和强碱、弱碱型等多种类型。按其骨架的化学组成可分为离子交换纤维素、离子交换凝胶和离于交换树脂等根本类型。 (三)离子交换层析的根本操作 1．交换剂的处理
确定了层析所用的交换剂的类型后，要对其进展适当的处理方可使用。处理包括以下四步：
①除去交换剂中的杂质；
②交换剂的溶胀，使交换剂的带电基团更多地暴露在溶液中； ③除去交换剂中很小的细粒，以免影响流速；
④离子交换剂的平衡离子转变成所需要的形式，即改型。
通常阳离子交换剂的处理顺序为碱洗→去离子水→酸洗→去离子水，而阴离子交换剂的处理顺序为酸洗→去离子水洗→碱洗→去离子水洗。
2．装柱
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为了得到成功的别离，装柱是最关键的一步。装柱的方式主要用以下两种： (1)重力装柱 (2)加压装柱。
3．平衡 4．加样
5．洗脱和收集
洗脱方式分为阶段洗脱和连续梯度洗脱两种。
(1)阶段洗脱法。又称逐次洗脱、阶梯梯度洗脱法，是指分段逐次改变洗脱液中的pH或盐浓度，使吸附在柱上的各组分洗脱下来。它是用几个具有—定pH和盐浓度的缓冲液按设计好的梯度依次洗脱，从而使混合酶液中几个对交换剂亲和力明显不同的组分分开，到达别离的目的。
(2)连续梯度洗脱法。又称线性梯度洗脱法，是通过连续改变洗脱液中的pH或盐浓度，使吸附柱上的各组分被洗脱下来。通常采用一种低浓度的盐溶液为起始溶液，另一种高浓度的盐溶液作为最终溶液。它的分辨率大大超过分段洗脱。在酶的制备中常用连续梯度洗脱法，它优于阶梯梯度洗脱法。
6．交换剂的再生和贮存
为了使用过的离子交换剂能再次使用，就需要对其进展再生处理。再生的方法通常是先用0.5～2mol/L高盐溶液洗涤。盐溶液应包含有离子交换剂的相反离子。然后，用0.2 mol/L 酸、碱反复洗涤以除去脂类、蛋白质等杂质。最后用水洗至中性，就可再次上柱使用。
二、凝胶层析 (一)根本原理
凝胶层析又称分子排阻层析、分子筛层析或凝胶过滤。它是指混合物随流动相经固定相(凝胶)的层析柱时，混合物中各组分按其分子人小不同而被别离的技术。 (二)凝胶的种类
凝胶的种类很多，常用的有葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶等。 (1)葡聚糖凝胶
凝胶颗粒大小一般分为粗、中、细和超细四类。颗粒越细，别离效果越好，因为它容易到达平衡，但流速慢。颗粒越粗，流速越快，会使区带扩散，使洗脱峰变得平和宽。在一般柱层析中，使用干颗粒直径在70 μm 左右较适宜 (2)琼脂糖凝胶。 (3)聚丙烯酰胺凝胶。 (三)凝胶特性的参数
用于表示凝胶特性的参数主要有以下几项： (1)排阻极限。 (2)分级围。 (3)水滞流量。
(4)凝胶颗粒的大小。 (5)床体积。 (6)空体积
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(四)凝胶层析的操作
凝胶居析的根本操作与离子交换层析大致一样。所要注意的事项有以下方面： (1)凝胶的选择 (2)溶胶 (3)装柱 (4)加样 (5)洗脱
(6)再生与保存
(五)凝胶层析的优点与用途
凝胶层析具有以下优点：①别离条件温和，因此不易引起生物样品的变性失活；②每次别离操作之后，层析剂无须再生就可重复利用；③工作围广，别离的分子质量围可从几百到数百万；④设备简单，别离机理简单，易于操作；⑤样品回收率高，几乎可达100％。
凝胶层析主要有脱盐与分级别离两大用途.
三、亲和层析
亲和层析也称亲和吸附层析，是利用生物活性物质之间的专一亲和吸附作用而进展的层析方法。
亲和吸附层析原理如图3－12所示，大致可分为以下三步： ①配基固定化：选择适宜的配基与不溶性的支撑载体偶联，或共价结合成具有特异亲和性的别离介质； ②吸附样品：亲和吸附介质选择性吸附酶或其他生物活性物质，杂质与层析介质间没有亲和作用，故不能被吸附而被洗涤去除；
③样品解析：选择适宜的条件，使被吸附的亲和介质上的酶或其他生物活性物质解吸。
〔二〕亲和吸附介质
亲和层析中常用辅酶、竞争性抑制剂等小分子物质作为配基。 (三)亲和层析的操作
亲和层析操作一般分进料吸附、杂质清洗、目标产物洗脱和层析柱再生4个步骤。
亲和层析的洗脱方法有两种：一种是特异性洗脱，另一种是非特异性洗脱。特异性洗脱是利用含有与亲和配基或酶具有结合作用的小分子化合物溶液为洗脱剂，通过洗脱剂与亲和配基或酶的竞争性结合，使酶脱附。非特异性洗脱是采用较多的洗脱方法，是通过调节洗脱液的pH、离子强度、离子种类或温度来使被吸附的大分子构象有所改变，从而降低了酶与固相配基之间的亲和力。 在酶的亲和层析过程中，为了防止酶变性失活，亲和层析剂免受损害，一般应在低温(0～10℃)的条件下进展操作。 四、疏水层析
疏水层祈也叫疏水亲和吸附层析，是利用外表偶联弱疏水性基团(疏水性配基)的疏水性吸附剂为固定相，根据蛋白质与疏水性吸附剂之间的弱疏水件性相互作用的差异进展别离纯化的层析技术。 〔二〕疏水性吸附剂
各种凝胶过滤介质经偶联疏水性配基后均可用作疏水性吸附剂。常用的疏水性配基主
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要有苯基、短链烷基(C3～C8)、烷氨基、聚乙二醇和聚醚等。
(三)疏水层析的操作
疏水层析的根本操作与其他层析大致一样。所要注意的事项有以下方面： １、层析柱的制备 2．平衡
3．加样与洗脱 4．再生
第三节 酶的电泳别离技术
利用电泳技术可对酶进展别离、纯化。 电泳的方法多种多样，根据所用支持物的不同，可以分为纸电泳、薄层电泳、薄膜电泳、凝胶电泳、等电聚焦电泳等。
现主要针对酶工程领域个采用较多的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和等电聚焦电泳两种电泳技术。
凝胶电泳是以各种具有网状构造的多孔凝胶作为支持体的电泳技术。凝胶电泳与其他电泳的主要区别在于凝胶电泳同时具有电泳和分子筛的双重作用，具有很高的分辨力。 凝胶电泳的支持体主要有聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。在酶学领域中，最常用的是聚丙烯酰胺凝胶。
不连续电泳系统存在4个不连续性：凝胶层的不连续性；缓冲液离子成分的不连续性；pH的不连续性；电位梯度的不连续性。
由于上述4种不连续性，电泳时会产生3种物理效应，即样品的浓缩效应、电荷效应以及凝胶的分子筛效应。 (1)浓缩效应。 (2)电荷效应。 (3)分子筛效应。
(二)影响凝胶聚合的因素
聚丙烯酰胺凝胶是电泳支持介质，其质量直接影响别离效果。影响聚丙烯酰胺凝胶聚合的因素有以下方面。 1．试剂质量 2．凝胶浓度
3．温度和氧气的影响
〔三〕聚丙烯酰胺凝胶电泳的优点与用途 以聚丙烯酰胺凝胶为支持介质进展电泳，可根据被别离物质分子大小及电荷多少来有效地别离酶和其他蛋白质。与其他凝胶相比，聚丙烯酰胺凝胶具有以下优点： (1)电渗作用比较小，样品别离重复性好。 (2)凝胶孔径可调。 (3)电泳分辨率高。
(4)化学稳定性和热稳定性好。 (5)机械强度高，透明有弹性。
PAGE应用广泛，可用于酶、蛋白质、核酸等生物大分子的别离纯化、少量的制备及定性、
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定量检测，还可用于其分子量、等电点的测定等。
需要指出的是，生化实验室中的常用的板式凝胶电泳装置的处理量很小，不适于别离制备。
二、等点聚焦
等电聚焦电泳利用蛋白质分子或其他两性分子等电点的不同，在一个稳定、连续的线性梯度中进展蛋白质的别离。
等电点聚焦电泳的操作过程 (1)pH梯度支持介质的制备 (2)电泳
(3)别离组分的检测
(五)等电点聚焦电泳的特点
等电点聚焦电泳具有以下显著的特点：
(1)具有很高的分辨率。能将等电点仅相差0.01～0.02pH单位的酶或蛋白质分开。
(2)显现的区带窄。一般电泳由于受扩散作用的影响，随着时间和泳动距离加长，区带越走越宽，而等电点聚焦能抵消扩散作用，使区带越走越窄
(3)聚焦力强。不管样品混合液加在电泳系统的什么部位，由于电聚用，各组分都可聚焦到其等电点位置，很稀的样品也可进展别离。
(4)可直接并准确测出等电点。其准确度可达0.01pH单位。
等电点聚焦电泳也存在一些缺点：
(1)要求用无盐溶液，而在无盐溶液中有些酶和蛋白质可能会发生沉淀。
(2)电泳后样品中的各组分都聚焦于其等电点，不适用在等电点发生变性的某些酶蛋白质。 (3)载体两性电解质对产品会产生一定的污染。
第四节 酶的结晶技术 一、盐析结晶法
盐析结晶是指在适当的温度和pH等条件下，于接近饱和的酶液中缓慢增加某种浓度的个性盐，使酶的溶解度慢慢降低，到达稍微过饱和状态，而析出酶晶体的过程。 二、有机溶剂结晶法
有机溶剂结晶是在接近饱和的酶液中慢慢参加某种有机溶剂，使酶的溶解度降低，而析出酶晶体的过程。
三、透析平衡结晶法
透析平衡结晶是将酶液装进透析袋，对一定浓度的盐溶液进展透析，使酶液逐步到达过饱和状态而析出结晶的过程。 四、等电点结晶法
等电点结晶是通过缓慢改变浓酶液的pH，使之逐渐到达酶的等电点，而使酶析出结晶的过程。
第四章 酶制剂工业化生产实例
第一节 淀粉酶类的生产
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淀粉酶属于于水解酶类，是催化淀粉、糖原、糊精中糖苷水解的一类酶的统称。此类酶广泛存在于动、植物和微生物中，几乎所有动物、植物和微生物都含有淀粉酶。它是研究较多、生产最早、产量最大和应用最广泛的一类酶。
按照水解淀粉的方式不同，主要的淀粉酶有: -淀粉酶、-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、脱支酶、环糊精葡萄糖基转移酶等。
-淀粉酶可由微生物发酵产生，也可从植物和动物中提取。目前，工业生产上都以微生物发酵法进展大规模生产-淀粉酶。有实用价值的-淀粉酶产生菌有：枯草杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、凝聚芽抱杆菌、淀粉液化芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、米曲霉、黑曲霉、拟孢霉等。不同菌株所产-淀粉酶在耐热，耐酸碱、耐盐等方面各有差异。其中，最适反响温度在60℃以上的命名为中温型-淀粉酶；最适反响温度在90℃以上的命名为高温-淀粉酶；最适反响pH≤5的为酸性-淀粉酶；最适反响pH≥9的为碱性-淀粉酶。 二) -淀粉酶的生产
微生物队-淀粉酶可以用固体培养，也可用液体深层培养法生产。现以枯草杆菌B.S.209诱变菌株B.S.796生产-淀粉酶为例加以介绍。 1．固体培养枯草杆菌JD-32生产法
(2)操作要点 ①培养基的配制 斜面培养基 种子培养基 发酵培养基 ②培养方法
斜面培养：从保藏斜面上挑取—环菌体接到试管斜面培养基上，在35℃培养48h。 种子培养：从活化斜面上桃取一环菌体接到摇瓶种子培养基中，35℃摇瓶培养一段时间后，用发酵罐扩大培养。 厚层通风发酵：发酵培养基冷却到38～40℃接入0.5％种子，在厚层通风培养室38～41℃培养20 h左右出曲风干。 ③提取
麸曲用1％食盐水浸泡3h(用量3～4倍)，然后过滤，调节滤液pH 5.5～6.0，参加10℃的酒精使终浓度为70％沉淀酶，沉淀经离心，浓酒精洗涤脱水后，25℃下风干粉碎即为成品。
2. 液体深层培养枯草杆菌B.S.209诱变菌株B.S.796生产法
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目前，我国液体深层发酵生-淀粉酶的菌株主要是枯草杆菌BF7658的突变菌株，如B.S.209、8a5、86315、K22、B. S.796等。下面以B.S.209诱变菌株B.S.796生产法为例进展介绍。
〔1〕工艺流程见图5-3
2)操作要点
①摇瓶种子培养
500m1三角瓶装发酵培养基50 m1，其组成为麦芽糖6％、豆粕水解液6％、Na2HP04•12H20 0.8％、(NH4)2SO4 0.4％、CaCl2 0.2％、NH4C1 0.15％，pH 6.5～7.0，接种后置旋转式摇床上，(37±1)℃下培养28h左右备用。 ②种子罐扩大培养
采用130 L夹套标准式培养罐，转速360r/min，37℃培养12～14h. ③1.5m3发酵罐发酵
1.5m3夹套发酵罐装液量600～700L。罐培养基的配置与培养条件如下： 麦芽糖液的制备：取玉米米粉或甘薯加水2～2.5份，调pH 6.2，加CaCl2 0.1％，升温至80℃，添加-淀粉酶5～10 U/g原料，液化后速在高压1～2kg/cm2下糊化30min，冷却至55～60℃，pH 5.0时添加细菌异淀粉酶20～50U/g原料和植物-淀粉酶100～200U/g原料，糖化4～6h，加热至90℃。趁热过滤即为麦芽糖液。
豆粕水解液的制备：取豆粕粉加水10份浸泡2h，然后在1kg/cm2下蒸煮30 min，
冷却至55℃，调pH 7.5，加蛋白酶50～100U/g原料，作用2h，过滤后浓缩至蛋白质含量为50％，即得豆粕水解液。
罐培养基的配制：用上述麦芽糖液配置成含麦芽糖6％、豆粕水解液6％～7% 、
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Na2HPO4•12H20 0.8％、(NH4)2SO4 0.4％、CaCl2 0.2％、NH4Cl 0.15％、豆油1kg、深井水500L，调pH 6.5～7.0。 罐培养基经消毒灭菌，冷却后接入3％～5％种子培养成熟液。培养条件为温度(37±1)℃，罐压0.5kg/cm2，风量l～20 h为1：0.48，20 h后1：0.67，培养时间28～36h。 ④提取
发酵完毕后，于发酵罐添加凝聚剂，pH6.3～6.5 ，升温至40～45℃后放入絮凝剂，维持一定时间进展预处理后，泵入板框压滤机进展过滤，水洗，合并洗液(或经浓缩)放入沉淀缸参加一定量淀粉，边搅拌边参加酒精，沉淀，湿酶经真空枯燥，即为成品酶。 二、-淀粉酶的生产
-淀粉酶淀粉酶广泛存在于植物(大麦、小麦、山芋和大豆类)及微生物中。该酶很早以前就被作为糖化剂用在酿酒、制糖工业中，1924年由Kuhn所命名，但微生物的-淀粉酶直到1974年才被发现。
(一) -淀粉酶的性质
-淀粉酶(E.C. 3.2.1.2)是淀粉酶类中的一种，又称淀粉1,4-麦芽糖苷酶。该酶水解淀粉时，不能作用于淀粉分子部，只能从-l,4糖苷键的非复原性末端顺次切下麦芽糖单位，同时麦芽糖复原性末端C1上羟基构型发生转位反响，变成-麦芽糖，因此被称为-淀粉酶。
一些植物的-淀粉酶作用的最适pH为5.0～6.0；微生物-淀粉酶最适pH为6.0～7.0。植物的pH稳定围为5.0～8.0，微生物的为4.0～9.0。-淀粉酶对热的稳定性因酶源不同而有差异。一些植物酶60～65℃很快失活；微生物酶耐热性更差，通常在40～50℃反响为宜。Ca2+对-淀粉酶有降低稳定性的作用，这与对-淀粉酶有提高稳定性的效果相反，利用这一差异，可在70℃，pH 6.0～7.0，有Ca2+存在时，使-淀粉酶失活，以纯化-淀粉酶。
(二) -淀粉酶的生产实例
目前，-淀粉酶的研究还不及-淀粉酶那样深入。对于-淀粉酶的生产，以前主要从植物中提取，1974年发现微生物能产生-淀粉酶以来，研究微生物来源的-淀粉酶也比较活泼，并且在工业生产中得到应用。 1、植物-淀粉酶的提取 (1)从甘薯中提取-淀粉酶
将甘薯磨浆提取淀粉后的新鲜废水，调节pH为3.7～4.5，可沉淀出80％-淀粉酶。-淀粉酶也可以用高岭土或活性白土吸附而廉价回收，也可以向滤去淀粉的废水中参加硫酸铵到饱和度50％～60％，盐析物经透析加填料烘干后的收率为50％。但在浓度低的场合，上述方法是不经济的 (2)麸皮中提取-淀粉酶
将麸皮加水1：5～7，在pH 6.0，45℃浸泡一定时间后，向过滤液中加硫酸铵至饱和度50％～55％进展盐折，分级沉淀经透析加填料进展枯燥，酶的收率达50％。麸皮中的-淀粉酶与大麦芽中的酶活力相当(表5-3)，适宜于麦芽糖浆生产。 2．微生物-淀粉酶的生产
由于于植物-淀粉酶的生产本钱比较高，微生物来源的产淀粉酶就越来越受到关注。目前对产-淀粉酶的菌种研究较多的是芽孢杆菌属的多黏芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、环状芽孢杆菌和链霉菌等。
下面以吸水链霉菌FRl602或ATCC21772生产-淀粉酶为例加以介绍。
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(2)操作要点
①培养基的配制：种子培养基、发酵培养基 ②培养方法
将菌种接于9L种子培养基中，于28℃通气和搅拌培养24h，接入发酵罐培养。在600 L发酵罐中参加300 L发酵培养基，于121℃灭菌30min，然后使其冷却，接种子罐培养的种子，于28℃通气和搅拌培养85h。 ③提取
发酵终了，将发酵液在40℃减压过滤，使其体积为原来的1/5。然后参加2倍体积冷乙醇到浓缩液。使-淀粉酶沉淀，枯燥沉淀物即为粗酶制剂，酶活性一般可达40 000U/g
二、葡萄糖淀粉酶的生产 (一)葡萄糖淀粉酶的性质
葡萄糖淀粉酶系统名称为-1,4-葡聚糖葡萄糖水解酶(E.C. 3.2.1.3)，大量用作淀粉的糖化剂，所以习惯上称之为糖化酶。糖化酶是最重要的工业酶制剂之一，广泛应用于酒精、白酒、抗生素、氨基酸、有机酸、甘油、淀粉等工业中，是我国目前生产量最大的酶制剂产品。由于酿酒酵母只能用葡萄糖或麦芽糖，不能用淀粉，因此要糖化酶将淀粉转化成葡萄糖。
糖化酶是一种外切型淀粉酶，该酶的底物专一性很低。它除了能从淀粉分子的非复原性末端切开-l,4糖苷键以外，也能切开-l, 3糖苷键和-l,6糖苷键，只是水解速度不同，产物均为葡萄糖。像-淀粉酶一样，它能使水解下来的葡萄糖发生构型变化，形成-D-葡萄糖。 糖化酶是一种糖蛋白。其糖化反响的最适温度和pH由于酶源不同存在差异。曲霉最适温度为55～60℃，最适pH为3.5～5.0；根霉为55～60℃，最适pH为5.4～5.5；拟孢霉为50℃，pH为4.8～5.0。
(二)葡萄糖淀粉酶的生产实例
最初的糖化酶工业生产是用根霉属的固体培养和液体培养方式，也有用拟孢霉属的液体培养，但是以上菌种培养液里所产酶单位较少，不宜于工业生产。现在工业上主要采用黑曲霉的液体深层培养法，所产的糖化酶耐酸，耐热，产量也高，是我国糖化酶主要的生产方法。 1．根霉固体培养法
下面以河根霉3.042固体培养生产法为例介绍葡萄糖淀粉酶的生产工艺 (1)工艺流程见图5-5
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(2)操作要点 ①菌种
菌种用8°Brix麦芽汁琼脂培养基保存，25～30℃培养5～7d后，菌丝布满，并形成孢子，呈灰黑色时即可置于5℃左右的冰箱保藏。2～3个月移植一次，室温保藏那么两个月移植一次。
②种曲制备
500mL三角瓶，装料40 g(麸皮和青糠8:2，混合物加水1：1.6拌匀)，121℃灭菌45 min，接种试管孢子2～3环后30℃培养2d，待菌丝长满，生成孢子后即可应用或置冰箱保存。 ③通风制曲
麸皮(或加米糠20％)加硫酸铵2.5％，加水1.6倍，蒸熟扬凉，保持含水分70％左右，接入种曲0.2％，在30℃左右装入通风曲箱，料厚17～25cm，箱底铺湿草帘，用以保湿，保温30℃，6～8h，中间间歇通风数次，待孢子发芽呼吸旺盛，品温上升到35℃以上，开场间歇通入预热30℃的空气吹散热气以保持品温30～32℃，曲房干湿球温差不宜超过1℃，经40余小时，孢子布满麸曲，酶活已达顶峰(7000U/g左右)，于是通入40℃热空气吹干，在水分低于15％以下，麸曲可以长期保藏。这种麸曲按每克淀粉使用300～350U糖化酶，在pH 4.8～5.0，55℃糖化40～48h，每克麸曲可糖化20 g淀粉，DE95以上 2 黑曲霉液体深层培养法
下面以黑曲霉AS.3.4309变种UV-11为例介绍液体深层培养法生产糖化酶的工艺。 (1)工艺流程见图5-6
(2)操作要点 ①种子制备
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固体孢子培养。在茄形瓶中加10g麸皮和10mL水，搅拌均匀后灭菌30min，冷却后接入一环斜面菌种，于31℃培养6～7d备用。
种子罐培养。玉米粉6％，黄豆饼粉2％，麸皮2％。在31℃下通风培养32h，通风量为为0.5VVm。当pH 下降到3.8，酶话在500U/mL左右，镜检菌丝生长正常，无杂菌污染时即可接入二级种子罐或发酵罐。 ②发酵
培养基配比为玉米粉12％，黄豆饼4％，麸皮1％，-淀粉酶添加量为100U/g(淀粉)，pH调至4.5以下。于30～32℃下通风培养90～110h。通风量1～12h为0.5VVm，12～14h为0.8VVm，24～28h为1VVm，84h后为0.8VVm。培养84h后每隔8 h测定pH、复原糖、酶活、并镜检菌体形态。当pH降至3.4，复原糖降至1.8％以下，酶活力上升至13600U/mL以上时，即可放罐。 ③提取
按硫酸铵盐析工艺提取糖化酶制剂。硫酸铵加量力55％，盐析静置12h，过滤，湿酶在40℃以下烘干称重，测定糖化酶活力，调至成品规定活力。调制时参加适量膨润土，吸附夹杂的糖苷转移酶，可提高产品质量。 ④液体酶制剂的制备
液体酶制剂是将发酵液参加苯甲酸钠作防腐剂而成，或是经超滤浓缩一倍后加防腐剂、稳定剂等(如异抗坏血酸、山梨醇)而成。液体酶制剂由于减少了提取工艺，本钱降低，故其价格廉价。但酶活保存时间较短，如何能长时间保存液体酶制剂的活力还有待进一步研究。
第二节 蛋白酶类的生产
蛋白酶是水解蛋白质和肽链的—类酶的总称。它广泛存在于动物脏、植物茎叶、果实和微生物中，但唯有微生物蛋白酶具有生产价值。微生物蛋白酶多以生产菌的最适pH为依据，分为中性蛋白酶、碱性蛋白酶和酸性蛋白酶。
一、酸性微生物蛋白酶 〔一〕酸性蛋白酶的性质
酸性蛋白酶广泛存在于霉菌、酵母茵和担子菌中，细菌中极少发现，其最适pH为3～4，相对分子质量30 000～40 000，等电点低(pH 3～5)。大多数酶在其活性中心含有两个天冬氨酸残基。酶蛋白中酸性氨基酸含量高，而碱性氨基酸含量低。
酸性蛋白酶在许多方面与动物胃蛋白酶和凝乳蛋白酶相似。常见的几种酸性蛋白酶的性质如表5-5所示。
酸性蛋白酶在pH 2～6围稳定。假设在pH 7，40℃，处理30 min立即失活。斋藤曲霉酸性蛋白酶，最适pH 2～3，在pH 4.0的培养液中稳定，但在pH 2.7，30℃可引起严重的失活。从溶液中游离氨基氮的增加，可以看出酶的失活是由于自溶：在pH 6～7酶发生变性失活，添加2mol/L NaCl可以增加酶的稳定性。紫微青霉酸性蛋白酶最适pH为2.6，而稳定pH为4.9。
一般霉菌酸性蛋白酶在50℃以上颇不稳定，斋藤曲霉酸性蛋白酶在pH 5.5，50℃，黑曲霉3.350的酶在pH 2.5，60℃处理20min可引起完全失话。但是紫微青霉酸性蛋白酶在60℃、杜邦青霉Kl014酸性蛋白酶在60℃经历1h也不致失活，后者在pH 4.5的最适温度为75～80℃。大孢子黑曲霉(A. niger var. macrosporus DBD-0406)酸性蛋白酶A的最适温度为70℃。有些酸性蛋白酶不耐低温，冰冻枯燥时也会引起失活。许多酸性蛋白酶分子中含有5％～10％多糖对酶稳定有益。
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(二〕生产菌种
酸性蛋白酶在1954年首先由吉田在黑曲霉中发现。许多真菌酸性蛋白酶生产菌种已经提纯并进展了鉴定(表5-7)。商品酸性蛋白酶的生产菌种，主要有黑曲霉、黑曲霉大孢子变种、斋藤曲霉、根霉、杜邦青霉、血红色陀螺孔霉和微小毛霉(凝乳酶)等少数菌株。
(三)酸性蛋白酶的生产实例
国最先投产的酸性蛋白酶是采用黑曲霉3.350液体深层培养法进展生产，在毛皮软化制革、羊毛染色、医药和啤酒澄清方面有广泛用途。下面介绍其生产工艺技术。
1 工艺流程(图5-7)
2．操作要点
(1)种子培养。将菌种接于500 L种子罐培养基中，于〔31±1℃〕 230r/min下通风培养26h，通风量为0.3VVm。
(2)发酵。5000L不锈钢发酵罐装3 000L培养基，于(31±1) ℃ 180r／min下通风培养，控制通风量0～24h为1:0.25VVm；24～48h 为1:0.5VVm；48h至完毕为1:1.0VVm，平均1:0.6 VVm左右。发酵72h，酶活性一般达2500～3200 U/m1。
(3)酶的提取。工业用的粗制品酶采用盐析法提取，将培养物滤去菌体，用盐酸调节至pH 4.0以下，参加硫酸铵至终浓度55％，静置过夜，倾去上清液，沉淀压滤去母液，于40℃烘干后磨粉。盐析工艺收率94％以上，枯燥后收率60％以上，酶活性为20万U/g。也可将发酵液滤除菌体后，使用刮板式薄膜蒸发器40℃浓缩3～4倍，直接作为商品。 (4)酶的纯化。供医药和食品工业使用的酶通常要进一步纯化。纯化方法有以下两种： ①离子交换法；将所得的粗酶加水浸泡(pH 3.0)、过滤或直接将上述发酵液离心滤除菌体后，用55％硫酸铵盐析后压滤，再将酶泥溶于0.005mol/L pH 2.5乳酸缓冲液，用通用两性一号离子交换树脂进展脱色(收率93％)，用真空薄膜刮板蒸发器于40℃浓缩至2倍以上(收率90％)，再用732阳离子、701阳离子树脂混合床脱盐(收率90％)，最后进展喷雾枯燥或冷冻
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枯燥、磨粉即成。成品为淡黄至乳白色粉末，酶活性为40万～60万U/g。 ②单宁酸沉淀法；在搅拌下向发酵滤液(pH 5.5左右)参加10％单宁酸，使单宁酸的终浓度1％左右，静置1h，离心收集酶与单宁酸的复合物。再向此复合物中参加10％聚乙二醇(分子量6 000)，使聚乙二醇用量相当原酶液的0.3％～0.5％，不断搅拌，离心去除单宁聚乙二醇聚合物，经此过程，酶液可以浓缩10倍，总收率90％以上。向浓缩酶液参加糖用活性炭3％(在pH 4.5左右)脱色，得到浅黄脱色酶液，酶回收率90％～95％，脱色酶液或用酒精在低温下沉淀，或用硫酸铵盐析制成浅色酶粉，其活性可达40万～60万U/g，总收率70％以上。 二、中性微生物蛋白酶 〔一〕中性蛋白酶的性质
大多数中性微生物蛋白酶是含锌离子的金属酶，相对分子量质量35000～40 000，等 电点为8～9，是微生物蛋白酶中最不稳定的酶，很易自溶，即使在低温冰冻枯燥，也会造成分子量的明显减少。性质见表5-8。 (二〕生产菌种
中性蛋白酶是最早用于工业生产的蛋白酶。生产菌种见表5-9。不少微生物的中性蛋白酶已经纯化，并进展了详细研究。商品中性蛋白酶的生产菌种主要是枯草杆菌、耐热解蛋白芽孢杆菌、寄生曲霉、米曲霉、栖土曲霉、灰色链霉菌等。 (三〕中性蛋白酶的生产实例
我国生产中性蛋白酶的菌种主要是枯草杆菌AS114、1.398、172，栖土曲霉3.94等。 下面以枯草杆菌AS l.398液体深层培养法为例介绍中性蛋白酶的生产技术。 1．生产工艺(图5-8)
2 操作要点
(1)菌种选育。菌种选育如图5-9所示。制好培养基接种后，30℃下培养26h，0～5℃冰箱保存。AS l.398的变异株AS l.398-14-11-14，产酶能力比母株提高19％，且较稳定。 (2)种子罐培养。种子罐径ф400mm，高850mm，容积150L，装料70 L，搅拌速度320 r/mn。培养基在9 800Pa灭菌30min。培养温度29～31℃(低温季节30～32℃)，通风量保持在1:0.5
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VVm，自然pH。培养10 h后镜检菌形，凡菌体瘦细，短而均匀者为优，酶活在400～600 U/mL较为适宜。
(3) 发酵罐发酵。发酵耀径ф200mm，高2800mm，搅拌转速220r/min，投料量 1200L。接种量6％～8％，培养温度按前期升温法培养，即在第5～8h，每小时升温2℃，9～12h，每小时降温2℃，第12h后保持30～32℃。通风量0～12h为1:0.6VVm；12～20h为1: 0.7VVm：20h后为1: 0.8VVm，搅拌转速320r／min。发酵26～28h，酶活力6 000～7000U/mL，pH 5.5左右，总糖约为1.5％，残糖为0.5％以下。
(4)酶的提炼与产品标准化。向发酵液参加CaCl2 0.4％，pH6.0～7.0，搅拌30min，压滤去杂质，清液用薄膜蒸发器在35～40℃，真空度9.6×l04～9.9×104Pa下浓缩至原体积的1/2以下，再加工业硫酸铵至浓度42％，盐析12～16h，除去上清液后，加硅藻土2％，经离心别离或压滤，取出酶泥，绞碾成细条，置真空度9.6×104～9.9×104Pa 35℃枯燥之后，磨粉即为成品。成品酶活性为10万U/g左右。总收率约55％，1t发酵液可得到酶粉约16kg。 提炼各工序酶的回收率统计见表5-10。原酶粉常需添加填料，以制得酶活均一的酶制剂，填料应选用不损害酶的活性、不吸湿，又不影响使用的材料。 CaCO3、淀粉、乳糖、明胶、硅藻土、Na2SO4、NaCl、MgO、NaHCO3等均是工业上常用的填料。
蛋白酶作药用时，需将粗酶纯化，工艺流程见图5-10。操作要点如下：粗酶加水(1: 10)浸提，再加浓度为70％的CaCl2溶液20％(体积分数)及25％(NH4)2SO4 (mg/L )作为净化助滤剂，过滤后得到澄清酶液，再加35％(NH4)2SO4盐析酶，过滤收集酶泥溶解于0.02mol/L pH 7.2磷酸盐缓冲液中，通过葡聚糖凝胶G-25脱盐。柱体为1cm×10 cm，柱中凝胶先用0.02mol/L pH 7.2磷酸盐缓冲液平衡，然后在柱顶注酶，通过的酶量为床体积的20％，流毕用0.02mol/L pH 7.2磷酸盐缓冲液洗脱，收集无盐酶液冷冻枯燥即可。按此工艺由粗酶到局部纯化酶的收率为50％以上，每克酶的活性提高22倍，到达120万U/g，酶的比活可提高4倍。粗酶液中的酶蛋白也可在5℃用丙酮沉淀后以70％丙酮反复洗涤脱盐，收率50％左右。将粗酶盐析分段，酶的比活可增加15～20倍。
(5)液体酶的制备。将发酵液过滤后，用刮板薄膜蒸发器，在35～40℃，真空度约85000Pa，浓缩3倍后，在酶的稳定pH(6.5～7.0)下，添加15％NaCl和2％乙醇，置密闭容器(以减少氧化引起的失活)，低温下可保存数月。
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三、碱性微生物蛋白酶 〔一〕碱性蛋白酶的性质
多数微生物碱性蛋白酶在pH 7～11围有活性。在以酪蛋白为底物时的最适pH以9.5～10.5为多。这种酶除水解肽键外，还具有水解酯键、酰胺键和转酯及转肽的能力。
多数微生物碱性蛋白酶不耐热，假设在50～60℃加热10～15min，几乎其中一半酶的活性下降50％，只有费氏链霉菌与立德链霉菌等的碱性蛋白酶，经70℃处理30min，酶活性仅损失10％～15％。
三、碱性微生物蛋白酶 〔一〕碱性蛋白酶的性质
多数微生物碱性蛋白酶在pH 7～11围有活性。在以酪蛋白为底物时的最适pH以9.5～10.5为多。这种酶除水解肽键外，还具有水解酯键、酰胺键和转酯及转肽的能力。
多数微生物碱性蛋白酶不耐热，假设在50～60℃加热10～15min，几乎其中一半酶的活性下降50％，只有费氏链霉菌与立德链霉菌等的碱性蛋白酶，经70℃处理30min，酶活性仅损失10％～15％。
(三)碱性蛋白酶的生产实例
地衣芽孢杆菌2709液体深层培养法生产碱性蛋白酶是国最早(1971年)投产的碱性蛋白酶，也是最大的一类蛋白酶，其产量占商品酶制剂总量的20％以上。此酶主要用于加酶洗涤剂制造及制革和丝绸脱胶。 1、工艺流程(图5-11)
2．操作要点
(1)菌种培养。制培养基，接试管斜面菌种，于37℃培养24h后储藏于5℃冰箱备用。 (2)种子培养。种子培养是将斜面种子接入茄子瓶(培养基和培养条件与斜面一样)培养后制成悬液，接入种子罐培养液中。种子罐(1000 L)装500 L种子培养基。在36℃下，通风量1: 0.7VVm，搅拌速度为250r/min下培养18～20h。 (3)发酵。10000L发酵罐装培养基5000L在36℃下通风(前期1: 1.5VVm，后期1: 0．2VVm)
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搅拌40h左右酶活为8 000～10000U/mL。
(4)提取。地衣芽饱杆菌菌体细小，发酵液黏度大，直接采用的常规离心或板框过滤的方法进展固液别离是十分困难的，而且也得不到澄清滤液。目前，国一般工厂都采用无机盐凝聚的方法或直接将发酵液进展盐析。前者即向发酵液中参加一定量的无机盐，使菌体及杂蛋白聚集成大一些的颗粒，再进展压滤。此法虽能除去菌体，但过滤速度仍较慢，且色泽较深；后者即直接向发酵液进展盐析，得到酶、菌体、杂蛋白混合体系。
为解决上述问题，可采用絮凝法来处理发酵液，其做法是：向发酵液中参加碱式氯化铝，使终浓度为1.5％，然后用碱将发酵液pH调节到8.5左右，再参加聚丙烯酰胺，使终浓度为80mg/ml，50r/min搅拌7min后，静置一段时间，然后在一定真空度下抽滤，向滤液中参加硫酸钠，使终浓度为55％，静止24h后，倾去上清液，加硅藻土2％，压滤后枯燥，磨粉，即为成品酶。
絮凝法的优点是过滤速度快，滤液澄清，经盐析后，所得到的酶活有所提高，色泽比无机盐法的酶粉浅得多。
第三节 纤维素酶的生产 一、纤维素酶的性质和作用机理 (一)纤维素酶的组分
纤维素酶是能降解纤维素的一种生物催化剂，它是由假设干种互相关联的酶组成的相当复杂的酶系，而非一种简单的酶。由于组成的复杂性，使得提纯困难，从而导致人们对其性质的研究不很透彻。根据组成其中各种酶功能的不同，将纤维素酶分为三大类(表-12)
二、生产菌种
研究较多的是产酶微生物，包括细菌、放线菌、真菌等。细菌类有红黄纤维弧菌、普通纤维弧菌、瘤胃球菌和荧光极毛杆菌等：放线菌纲有链霉菌、玫瑰色放线菌小单胞菌、纤维放线菌及黑红旋丝放线菌等：真菌类主要有木霉(绿色木霉、里氏木霉、康氏木霉等)、青霉、曲霉和根霉等。
筛选和培育高产的菌种是生产纤维素酶的关键。 二、生产菌种
研究较多的是产酶微生物，包括细菌、放线菌、真菌等。细菌类有红黄纤维弧菌、普通纤维弧菌、瘤胃球菌和荧光极毛杆菌等：放线菌纲有链霉菌、玫瑰色放线菌小单胞菌、纤维放线菌及黑红旋丝放线菌等：真菌类主要有木霉(绿色木霉、里氏木霉、康氏木霉等)、青霉、曲霉和根霉等。
筛选和培育高产的菌种是生产纤维素酶的关键。 (一)固体发酵法生产纤维素酶 1．工艺流程(图5-13)
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2．操作要点
(1)试管斜面菌种培养 ①试管斜面培养基。 ②接种与培养。 (2)种子扩大培养 ①种子培养基制备。 ②接种与培养。
(3)厚层通风发酵培养 ①发酵培养基制备。 ②接种与发酵培养。 (4)别离提纯 ①压滤离心 ②沉淀枯燥
〔二〕液态深层发酵法生产纤维素酶 1.工艺流程〔图5-15、图5-16〕
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2．操作要点
(1)茄子瓶斜面菌种培养 ①培养基。 ②接种与培养。 (2)种子、发酵培养
采用逐级发酵罐培养的方法，根据发酵规模来确定采用几级培养。 ①种子培养基。 ②发酵培养基。 ③发酵方法。 (3)酶制剂的制各
发酵液经抽滤，除去固形物和菌体，得清液，将酶液调pH值为5，先用60％乙醇沉淀，再用95％乙醇洗涤2～3次，沉淀完全后用低温离心机离心，别离沉淀，将全部沉淀低温枯燥后粉碎，即得纤维素酶粉剂
第四节 果胶酶的生产 一、果胶酶的分类与性质 〔一〕分类
果胶酶是指水解果胶质的一类复合酶，包含有多种组分。果胶酶制剂中至少含有6种水解果胶分子上的不同位点的酶类。它可分为果胶质解聚酶与果胶酯酶两大类，
二、果胶酶的生产
〔一)臭曲霉固体培养生产果胶酶 1、工艺流程(图5-17、图5-18)
2．操作要点 (1)种曲制作。
将甜菜渣: 麸皮：(NH4)2SO4=(25％～50％) : (74％～79％): 1％ 的比例混合后，加水制成含水分60％的培养基，接种三角瓶种子0.1％，堆积保温，上帘，35～37℃培养，当温度上升到38℃时翻帘降温，孢子成熟得种曲。
(2)固体制曲。
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(3)酶的提纯。用水抽提酶，得含固形物7％～8％的抽提液，向抽提液参加乙醇(乙醇浓度达80％，即1体积酶抽提液约参加5体积乙醇。混合后pH为5.3～5.4)，使酶沉淀，果胶酶的收率为80％～88％。由1t麸皮曲抽提可制得150～200kg果胶酶。其酶活性为55～80U/g。
2．操作要点 (1)种曲制作。
将甜菜渣: 麸皮：(NH4)2SO4=(25％～50％) : (74％～79％): 1％ 的比例混合后，加水制成含水分60％的培养基，接种三角瓶种子0.1％，堆积保温，上帘，35～37℃培养，当温度上升到38℃时翻帘降温，孢子成熟得种曲。
(2)固体制曲。
(3)酶的提纯。用水抽提酶，得含固形物7％～8％的抽提液，向抽提液参加乙醇(乙醇浓度达80％，即1体积酶抽提液约参加5体积乙醇。混合后pH为5.3～5.4)，使酶沉淀，果胶酶的收率为80％～88％。由1t麸皮曲抽提可制得150～200kg果胶酶。其酶活性为55～80U/g。
2．操作要点
(1)斜面培养。
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(2)种子制备。 (3)发酵。
(4)后处理。将发酵液用压滤机压滤除渣，由1.63m3发酵液得滤液1.48m3。经超滤浓缩到144L(10.3倍)，酶活力由581U/m1提高到4 254U／m1(7.23倍)，参加酒精沉淀酶，枯燥，粉碎，得到活力92 629U/g的酶粉4.95kg。各步回收率如表5-17所示。
第五章 酶在食品中的应用 第一节 酶在烘烤中的应用 一
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二、果汁生产与水果处理中的酶 (二〕降解细胞壁的酶
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(1)果胶酶 (2)半纤维素酶 (3)淀粉酶 2、苹果汁去果胶 三、酿造业中的酶
简化了的酿造方案，酿造过程示意 ·研磨：减小干麦芽的体积
·制麦芽浆：向麦芽加水；控制升温以使酶降解蛋白质和碳水化合物 ·酿造：煮麦芽汁
·过滤：将用过的谷物和大多数物质进展别离(过滤) ·将大多数物质冷却
·发酵：将糖转化为酒精和二氧化碳 ·过滤：将酵母与啤酒别离
·成熟：不溶物的沉降、邻二酮(vicinal diketones)的复原 ·包装：桶装、瓶装、罐装 ·巴氏消毒：改善微生物稳定性
这一方案中有四个步骤直承受酶影响(制麦芽浆、发酵、成熟和包装)；几个过滤步骤也强烈的受到酶的间接影响。酶对最终产品的几项品质有着重要的作用，如外观、口感和经济性。
从发芽开场，比方在制浆之前，储存、研磨、浸泡过程中每一种酶的浓度都会 发生某种程度的改变。每一组酶的固有性质不会发生改变(温度稳定性、底物亲和性、pH依赖性等)，但酶活性的表达那么要依赖于反响条件(时问、温度、pH 、无机盐、其他酶等)如制麦芽汁的条件。
由于酿造以及制麦芽浆是高度优化的过程，因此 ，如果麦芽浆中的酶活性过低将导致如下不良后果。
·提取量变得过低 ·麦芽汁别离时间变长 ·发酵过程速度过慢 ·产生的酒精量过少 ·啤酒滤过率降低
·啤酒失去香味(双乙酰) ·啤酒稳定性变差
辅助酶被用于补充这些原生麦芽酶，以解决或防止这些问题。另外，酶还可用于改善酿造过程(例如更好的附加液化作用、更短的啤酒成熟时问、更廉价的生产原料)。最后，新酶的使用可以使生产“非传统〞型啤酒成为可能(低热量“轻啤酒〞、IMO啤酒、“起泡沫的酒〞；
〔二〕发芽与制浆中的酶 使用外源酶的三个领域。
①在酿造过程中解决或防止问题的发生； ②改进酿造过程； ③非传统酿造类型。
〔三〕用于解决和防止问题出现的酶 1、制浆过程中的淀粉酶
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2、发酵过程中的真菌α-淀粉酶 3、制浆过程中的β-葡聚糖酶 4、半胱氨酸肽链切酶
5、制浆过程中的葡糖淀粉酶
〔四〕用于改善过程的酶 1、添加物发酵
向麦芽浆中添加热稳定的细菌α-淀粉酶； 2、改进了的制浆过程 〔1〕蛋白酶 〔2〕支链淀粉酶 〔3〕植酸酶
〔4〕淀粉酶制剂/β-淀粉酶 3、货架期的改善
葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶 4、加速熟化
利用外源酶α-乳酸乙酰脱氢酶[ALDC]产生丁二醇而不是丁二酮。ALDC的使用消除了一个需要延长熟化期的主要原因。
5、淀粉-浊雾的去除
真菌-淀粉酶能够通过水解淀粉的-1,4糖苷键，防止淀粉-浊雾的产生。 〔五〕特殊酿造过程
第六章 酶的非食品应用
第一节 家用洗涤剂中的酶 酶的类型 〔1〕蛋白酶 〔2〕淀粉酶 〔3〕脂肪酶 〔4〕纤维素酶 (5)甘露聚糖酶
第二节 自动洗碗机洗涤剂中的酶制剂
为了适于在自动洗碗机洗涤剂ADD中使用，酶必须具备以下性质： ·在碱性pH下活性最高； ·在20～70℃有效； ·在60℃的高温下稳定；
·在其他清洁剂组分，如外表活性剂、增洁剂(例如磷酸盐、硅酸盐等)和活性漂白剂存在的情况下，无论储藏或使用过程中均保持稳定；
·对污物专一性低，即具有足够广谱的特异性以使各种蛋白质和淀粉降解。 第二节 自动洗碗机洗涤剂中的酶制剂
为了适于在自动洗碗机洗涤剂ADD中使用，酶必须具备以下性质： ·在碱性pH下活性最高； ·在20～70℃有效； ·在60℃的高温下稳定；
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·在其他清洁剂组分，如外表活性剂、增洁剂(例如磷酸盐、硅酸盐等)和活性漂白剂存在的情况下，无论储藏或使用过程中均保持稳定；
·对污物专一性低，即具有足够广谱的特异性以使各种蛋白质和淀粉降解。 第三节 用于谷物湿法研磨的酶
一、玉米转换为高果糖玉米糖浆〔HFCS〕过程回忆
使用湿法研磨使用湿法研磨将玉米转换为淀粉需要六个主要步骤，而将淀粉进一步转换为HFCS又需要五个步骤：
①将玉米粒浸泡在二氧化硫溶液中进展软化；
②将玉米粒进展粗磨，从淀粉、纤维和蛋白质中释放出含油的胚芽； ③旋风别离器别离胚芽；
④细磨使淀粉从纤维素和蛋白质中游离出来； ⑤从蛋白质和淀粉中筛分纤维素； ⑥从淀粉中离心别离蛋白质；
⑦用a一淀粉酶水解淀粉形成糊精；
⑧用葡糖淀粉酶水解糊精，通常加少量淀粉剪枝酶以产生葡萄糖； ⑨用葡萄糖异构酶使葡萄糖异构成葡萄糖和果糖的混合物； ⑩用液相色谱法从葡萄糖和其他产物中别离出果糖；
⑾将果糖和一些葡萄糖及其他副产品混合得到HFCS55(55％果糖)；
第四节 牲畜饲料添加酶
酶用于饲料添加一般认为有以下几个原因：
(1)对饲料中ANFs的降解，增强牲畜的品质，比方增肥或更好的饲料利用力； (2)破坏饲料中谷类的化学构造，释放额外养分，使谷类饲料增值； (3)提高牲畜对不易获取的蛋白、淀粉以及矿物质的利用率； (4)为幼畜补充源酶；
(5)减少饲料养分的变化，使牲畜品质均一，进而提高收襦；
(6)降低牲畜排泄物中未消化成分对环境造成的污染，尤其是肌醇六磷酸酶(phytase)的添加使用，减少了磷的排放。
第五节 酶在纺织工业中的应用
一、棉的漂白
棉的漂白酶法的优点如下。
·脱浆生成的葡萄糖被消耗，降低r废水处理中的BOD值； ·过程中产生的葡萄糖酸是一种很好的金属离子螯合剂；
·这一过程易与酶法脱浆和洗涤过程结合，形成一个单一集成的棉预处理 过程。
酶法脱浆、洗涤和漂白过程集成后得到的产品具有令人满意的亲水性和洁白度，同时也减少了洗涤水用量。葡萄糖氧化酶已被固定化来实现重复利用。
三、棉的精加工
用生物抛光(biopolishing或者去球(depilling)法可以使棉布外表复新，这是去除绒毛和
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绒球以改善棉布表观的方法，能获得如下所述效果。
·更清洁的外表，更清爽的感觉； ·增加柔软度和下垂感；
·亮彩(颜色复新，消除灰色外表)； ·抗起绒和起球。
酶法相对于传统的化学漂白法的优势如下： ·形成新的外表、式样和润饰效果[比方，铸灰色(grey cast)或者古式润饰(antique finishes)]； ·增强帆布抗磨损性能；
·高磨损程度下最大化的保持力(维持纤维素构造)； ·防止返染，改进衣料色彩比照度。
第六节 酶在纸浆和造纸工业中的应用
在纸浆和造纸工业中成功引入酶技术至少需要以下几个要素： 1、酶的应用要能够获得可观的经济效益
2、纤维材料的性能和加工工艺必须得以保持或加以改进 3、过程运行能力不能发生不必要的变化
4、必须有大量的可用酶制剂，对中试规模以及随后的工业应用来说价格要合理。
第七章 酶在有机合成中的应用 第一节 概述
与化学反响相比，由于酶的特殊性质，酶法转化具有以下不同的性质。 (1)反响的条件温和，一般在pH5～8，温度为20～40℃的水相中 反响。
(2)许多酶对有机溶剂具有一定的耐受能力。
(3)酶是高效催化剂，与没有催化剂反响相比，酶催化反响速率可以提高105～1012
倍。
(4)酶对催化的反响和识别大量底物的位点具有高选择性。
(5)除了化学选择性外，许多酶都具有高度的对映体、区位和／或手性选择性。 由于对复杂的、生物相关物质和高效制备相关问题解决的要求越来越高，因此，基于酶的对映体识别性质，使得有机合成中酶分子的研究呈指数增长。
第二节 酶法转化实例 一、水解酶合成作用 1、酰化作用 2、脱酰化作用 3、手性拆分 二、商业应用
1、非立体选择生物催化反响 2、生物催化拆分过程
第八章 治疗用酶
第一节 在治疗中应用酶的需求
酶却在以下三大领域成功地应用于临床治疗：
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(1)取代那些由于遗传性基因疾病而导致缺失或缺陷的酶；
(2)取代那些由于获得性疾病所致在器官过正常途径合成缺乏的酶； (3)提供依赖于某种酶的催化活性的特异性生物效应。
此外，某些酶也可以作为其他治疗的支持物或者用来从血液或组织中除去有毒的和没有用的物质
要想能够作为有效的治疗药物，酶必须符合以下要求。 ·酶必须能够到达身体或者组织器官中的作用位点。 ·酶在靶向作用位点的条件下具有活性。这些条件包括所需底物、辅底物／辅酶是否可以获得，恰当的氧化复原电势、适宜的pH以及抑制剂或者饱和剂是否存在。
·酶必须足够稳定以保证适宜的药物代，例如，酶作用时间所需要的相应浓度和活力水平。
·酶必须有足够的溶解度，这样才可以通过静脉、肌肉或者皮下途径起作用。
·酶必须足够纯，以防杂质引起不期望的副反响发生，例如微生物毒素，热原或者其他有害物质。
·必须产生依赖所用酶的特殊活性的治疗效果。
酶在治疗中的缺点： 1、不稳定性；
2、在血液中非常普遍存在的皮抑制素可能会破坏酶的催化活性； 3、生物可获得性； 4、细胞渗透性； 5、免疫性；
6、吸入酶粉可以造成过敏反响，尤其对于蛋白质酶类药剂； 7、制造和表征。
酶在治疗中也有许多重要优势。
·蛋白药物比化学合成的小分子化合物具有更少的副反响(包括畸形影响，teratogenic effect)，副反响使得新合成的小分子化合物(new chemical entities，NCEs)的平安性不可预测。
·研发时问短。 ·提高稳定性。
·减少免疫反响。如通过化学(PEGylation)或基因修饰方法覆盖或者去除能够被免疫系统识别的蛋白外表抗原位点。
·实现对特定组织／细胞的靶向性。
·通过降低分子尺寸(muteins)或者通过融合序列能够介导膜渗透以提高组织穿透性。
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