蛋白裂解液

蛋白质的定位与蛋白质裂解液的选择：全细胞：NP-40或RIPA 细胞质（可溶）：Tris-HCl 细胞质（细胞骨架）：Tris-Triton 细胞膜：NP-40或RIPA 细胞核：RIPA 线粒体：RIPA

RIPA裂解液配方

1ml RIPA buffer contains 35μl proteinase inhibitorand 10μl phosphatase inhibitor

RIPA buffer 1M Tris-HCl (pH7.5) NaCl Na-deoxycholale EDTA(pH8.0) NaF Nonidet P40 Aprotinin10μg/μl 5 ml 41 mg 1 ml 100μl 最终浓度 50mM 0.15 M （0.1%） （1%） 10μg/ml 加水到 100ml

Aprotinin 10μg/μl ；用10mM HEPES-KOH（PH8.0）溶解，备用.

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Nonidet P-40简称NP-40，乙基苯基聚乙二醇,常常使用非离子性去垢剂.

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Na-deoxycholale，脱氧胆酸钠，离子型去垢剂.离子型去垢剂主要作用有：裂解细胞；溶解蛋白，尤其是可以溶解一些难溶于水的蛋白，如膜蛋白等；很适合做WB，但在Co-IP

中使用，需要谨严.

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亮抑霉肽（Leupeptin）：抑制丝氨酸蛋白酶包含胰蛋白酶、纤溶酶、猪胰激肽原酶）和半胱氨酸蛋白酶（包含木瓜蛋白酶和组织蛋白酶B）

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抑肽素A（Pepstatin A）抑制各种天门冬氨酸蛋白酶，例如组织蛋白酶D、肾素、胃蛋白酶、细菌天门冬氨酸蛋白酶和HIV蛋白酶；

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胰凝乳蛋白酶抑制剂（Chymostatin）抑制具有糜蛋白酶类特异性丝氨酸蛋白酶（包含糜蛋白酶、胃促胰酶、组织蛋白酶 G）和大多数丝氨酸蛋白酶（包含组织蛋白酶B，H，L）

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抗木瓜蛋白酶（Antipain）抑制木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和纤溶酶.

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氟化钠抑制酸性磷酸酶

正钒酸钠：抑制碱性磷酸酶和酪氨酸磷酸酶 （tyrosine phosphatase）

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焦磷酸钠 （sodium pyrophosphate）：抑制丝氨酸-苏氨酸磷酸酶（serine－threonine phosphatase） .

在与蛋白相关的检测中，首先最关键的一步即是蛋白质的提取.蛋白质的提取过程中，我们要常常加和蛋白酶抑制剂以防止蛋白质的降解.别的在磷酸化蛋白的研究过程中，磷酸酶抑制剂也是必不成少的，本文总结了常常使用的蛋白酶抑制剂PMSF，Leupeptin 亮肽素，Aprotinin抑肽酶，Pepstatin胃蛋白酶

抑制剂，EDTA-Na2等以及磷酸酶抑制剂NaF氟化钠，Na3VO4 原矾酸钠 ，BETA-glycerophosphate 甘油磷酸钠，Na2P2O4 焦磷酸钠等.对这些蛋白酶抑制剂的溶解配制，贮存液与工作液浓度，保管都做了详细的说明. 蛋白酶抑制剂 PMSF：

使用：贮存浓度：200mM，工作浓度：1mM

Leupeptin 亮肽素

特性：抑制丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶如胰蛋白酶，木瓜蛋白酶，纤溶酶，和组织蛋白酶B

溶解性：高度溶于水（1mg/ml）.4℃一周稳定,分成小份冷冻在-20℃至少6个月

使用：贮存浓度：1mg/ml，工作浓度0.5 ug/ml (1mM)

Aprotinin抑肽酶

特性：丝氨酸蛋白酶抑制剂，抑制纤维蛋白溶酶， 激肽释放酶，胰蛋白酶，糜蛋白酶的高活性.不抑制凝血酶或因子X. 溶解性：易溶于水（10mg/ml）或缓冲液（例如，tris，，pH8.0）.pH约7-8的溶液在4℃可保管1周，分装保管在-20℃可至少保管6个月.防止反复冻融, pH>12.8的碱性环境可以使其灭活. 分子量：6,512

使用：贮存浓度:1mg/ml, 工作浓度：0.06–2.0 ug/ml(0.01–0.3 uM)

Pepstatin胃蛋白酶抑制剂

特性：抑制天冬氨酸（酸）蛋白酶如胃蛋白酶，肾素，组织蛋白酶D，凝乳酶， 许多微生物酸性蛋白酶

溶解性：溶于甲醇约1mg/ml； 可溶于乙醇，过夜溶解可达到1 mg/ml；在6当量乙酸中溶解度为300ug/ml.4℃稳定一周，分装储存于-20℃时可保管1个月

使用：贮存浓度：1mg/ml，使用浓度：0.7 μg/ml(1 μM) EDTA-Na2

特性：金属蛋白酶抑制剂

溶解性：溶于水至0.5M，在pH8-9的条件下，4℃

使用：工作浓度：0.2–0.5 mg/ml(0.5–1.3 mM)，不需现用现配，在溶液pH值调至8-9时再加入.

磷酸酶抑制剂 NaF氟化钠 溶解性：溶于水 分子量： 41.99

使用： 贮存液：5M 工作浓度：10-20mMNa3VO4 原矾酸

钠

分子量：183.91

溶解性：溶于水，我们购买过来的是原矾酸钠.原矾酸钠需要颠末处理以后才干成为激活的矾酸钠,激活的矾酸钠才具有抑制去磷酸化的作用.原矾酸钠变成激活的矾酸钠的过程是: 100mM原矾酸钠激活储存液配制

(1).取的原矾酸钠溶解于10ml的双蒸水中,加酸调节PH至10(颜色变黄) (2).煮至无色 (3).室温冷却 (4).重调PH至10

(5)重复（１）（２）（３）（４）直至溶液坚持无色，而且ＰＨ稳定于10,分装100ul/管,每10ml裂解液加一管.(终浓度为1mM),-20度保管.

使用： 贮存液：100mM 工作浓度：1mMBETA-glycerophosphate 甘油磷酸钠 溶解性：溶于水 分子量：306.11

使用：贮存液：100mM 工作浓度：25mMNa2P2O4 焦磷酸钠 溶解性：溶于水 分子量：265.9

贮存液：100mM, 工作浓度：1-2 mM

SDS ，NP-40 ，TritonX-100这三种去垢剂的作用是分歧的，或者说作用力气强弱分歧.

SDS属于离子型去垢剂，最利害，基本可以把细胞完全破掉，DNA会释放出来，裂解液变得很粘稠.

NP-40是很温和的去垢剂，1%浓度的基本可以破坏掉胞膜，而对核膜破坏的作用弱，连系特定的buffer可以获得胞浆蛋白.

TritonX-100的才能介于NP40和SDS之间，偏向于NP40，也是常常使用的细胞裂解液成分之一，在呵护蛋白活性方面有一定作用（SDS基本会使蛋白变性失活）. Brij Buffer I

Tris-HCl (1M, pH 7.5) EDTA (0.5 M) NaCl (5M) Brji 96 (10%) NP40 (10%) ddH2O to Total volume

1 millilitre (ml) millilitre (ml) 3 millilitre (ml) millilitre (ml) millilitre (ml) 100 millilitre (ml) 100 millilitre (ml)