６８６ Ｇｕａｎｇｘｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｊｕｎ．２０１２，Ｖｏ１．３４，Ｎｏ．６ 在糖尿病肾病（ｄｉａｂｅｔｉｃ ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ，ＤＮ）早期阶 段肾小球内有巨噬细胞浸润，核因子一ＫＢ（ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ—ＫＢ，ＮＦ—ＫＢ）活性明显增加…。炎症因子［如肿 瘤坏死因子一ｏ【（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ— ，ＴＮＦ—ｏ【）、白细 （身高、体重、ＢＭＩ）。所有入选的２型糖尿病患者均 先给予糖尿病常规治疗，包括糖尿病饮食、低盐低脂饮 食、口服降糖药，待血糖稳定１个月［空腹血糖（ＦＢＧ） ≤７ ｍｍｏｌ／Ｌ，餐后２ ｈ血糖（ＰＢＧ）≤１０ ｒｅｏｔｏｌ／Ｌ），糖化 胞介素＿ｌ５（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－６，ＩＬ－６）、白细胞介素－１ ｐ （ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ一１ｐ）］可通过ＩＫＫ／ＮＦ—ＫＢ、Ｃ—Ｊｕｎ氨基末 血红蛋白（ＨＢＧ）７．０％～７．５％］。观察比较两组炎症 指标：外周血ＮＦ．ＫＢ ｐ６５的磷酸化水平、血清炎症因子 超敏Ｃ反应蛋白（ｈｓ—ＣＲＰ）、ＴＮＦ一仅、ＩＬ－６、ＩＬ一１Ｂ，生化指 标：ＦＢＧ、ＰＢＧ、ＨｂＡ ｃ、总胆固醇（Ｔｃ）、三酰甘油（ＴＧ）、 高密度脂蛋白（ＨＤＬ）、低密度脂蛋白（ＬＤＬ）、空腹胰 岛素（ＦＩＮＳ），计算胰岛素抵抗指数（ＨＯＭＡ－ＩＲ），测ＤＮ 端激酶通路、细胞因子信号抑制物通路等系统的活化 干扰胰岛素的信号传导，引起和加速肾脏疾病的发生 和发展，以ＮＦ—ＫＢ为网络中心的内皮细胞活化及炎 症因子参与了糖尿病及血管并发症的发生发展 。 本研究通过观察老年ＤＮ早期患者外周血单个核细 胞中ＮＦ—ＫＢ ｐ６５的磷酸化表达和血清ｈｓ—ＣＲＰ、 组尿白蛋白排泄率（ＵＡＥＲ）。其中分别从ＤＮ组、ＮＣ 组随机抽取２０例、１Ｏ例（约按３：１比例）患者，应用免 疫印迹（Ｗｅｓｔｅｎ ｂｌｒｏｔ）分析法检测外周血单核细胞 （ＰＭＮＣ）中ＮＦ．ＫＢ ０６５的磷酸化水平。 １．３．２实验方法：禁食１０ ｈ后，于清晨空腹抽静脉 血，按试剂盒要求分离血清，一８０％冰箱保存待测。 ＰＭＮＣ ＮＦ—ＫＢ ０６５（ｓｅｒ５３６）磷酸化水平用Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ＴＮＦ—Ｏｔ、ＩＬ－６、ＩＬ．１Ｂ炎症因子水平，探讨ＮＦ－ＫＢ表达 水平与血糖、血脂、胰岛素抵抗、尿白蛋白排泄率等因 素的关系。 １资料与方法 １．１临床资料选择２００７年８月至２０１０年８月我院 分析：以ＦｉｃｏＵ淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离 ＰＭＮＣ，调整细胞数量为３．８ Ｘ １０。，ＢＣＡ法检测总蛋 白含量。每样品取３Ｏ ｇ上样，ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳， １００ Ｖ恒压设定时间为９０ ｒａｉｎ。转膜，ＴＢＳ漂洗。室 温封闭６０ ｍｉｎ。按照１：１ ０００用碧云天生物技术研 究所提供的Ｗｅｓｔｅｒｎ一抗稀释液稀释ＮＦ—ＫＢ ｐ６５抗 住院、门诊首诊的老年２型糖尿病肾病早期患者（ＤＮ 组）６６例，男性３６例，女性３０例，年龄（６５．３±７．４）岁， 病程（１１．１－Ｉ－６．６）年；对照组（ＮＣ组）为我院健康体检 者３０例，男１６例，女１４例，年龄（６４．３＂４－７．３）岁。两 组的年龄、性别、男女比、ＢＭＩ、血压差异无统计学意义 （Ｐ＞０．０５）。见表１。 表１两组临床资料比较（ ±ｓ） 组刘 “ ＮＣ组ＤＮ组体。把经过封闭的蛋白膜与稀释好的一抗４ｑＣ缓慢 摇动过夜，确保稀释的抗体至少能在摇动的瞬间覆盖 蛋白膜。按照Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ的实验步骤进行后续的洗 ＢＭ１ （ｋｇ／ｍ。） 年龄 （岁）收缩压 （ｍｍＨｇ） 舒张压 （ｍｍＨｇ） 涤、二抗孵育、洗涤和检测等操作。结果以 ａｌｐｈａｉｍａｇｅｒ ２２００多功能凝胶成像仪定量扫描条带灰 ３Ｏ ２３．０３±１．４８ ６４．３ ４－７．３ １３２．５４±７．４ｏ ７６．８５－ｉ－６．３８ ６６ ２３．４０±１．２７ ６５．３±７．４ １３６．１２±５．８Ｏ ７７．２４±７．５Ｏ 度，以ｐ６５蛋白条带／８一ａｃｔｉｎ蛋白条带的比值反映核 因子ＫＢ ｐ６５（ｓｅｔ５３６）的磷酸化水平（抗ＮＦ—ＫＢ Ｐ６５抗 ｔ值 Ｐ值１．２７１ ０．２０７ １．３５８ ０．１７３ １。９７３ ０．０５５ １．８７０ ０．０６１ 体购自碧云天生物技术研究所）。ｈｓ—ＣＲＰ用免疫荧 光分析法。用Ｅｌｉｓａ法测定ＴＮＦ一 、ＩＬ－６、ＩＬ一１Ｂ（试剂 盒购自上海船夫生物有限公司）。用全自动生化分析测 定血生化指标ＴＣ、ＴＧ、ＬＤＬ—Ｃ、ＨＤＬ—Ｃ、ＦＢＧ、ＰＢＧ，用亲和 １．２纳入标准所有糖尿病患者符合１９９９年ＷＨＯ 糖尿病诊断标准进行诊断和分型，３个月内至少２次 ＵＡＥＲ ２０～２００ Ｉｘｇ／ｍｉｎ。临床上无明显蛋白尿；所有 受试者体质量指数ｌ８．５—２４．９ ｋｇ／ｍ 。２周内未使 用维生素Ａ、维生素Ｅ、维生素ｃ，阿司匹林、调脂药、 层析微柱法测定ＨｂＡ Ｃ。用放免法测定ＦＩＮＳ。胰岛素 抵抗指数（ＨＯＭＡ．ＩＲ）＝（ＦＢＧ Ｘ ＦＩＮＳ）／２２．５。ＵＡＥＲ测 定：留２４ ｈ尿，ＬＵＭＩＮＯ化学发光分析仪测定尿微量白 蛋白（ＡＬＢ），尿白蛋白排泄率（ＵＡＥＲ）＝尿微量白蛋 白×尿量／１ ４４０，用 ｇ／ｍｉｎ表示，嘱患者在留尿前２４ ｈ 和留尿过程中不进高蛋白饮食，不做剧烈运动。 １．４统计学分析所有数据采用ＳＰＳＳ １３．０统计软 ＡＣＥＩ、ＡＲＢ类药物、胰岛素、胰岛素增敏剂及抗氧化 药物，均为非吸烟者。排除心脏、肝脏及其他全身疾 病引起的蛋白尿；原发性泌尿系统疾病；高血压病、高 脂血症、糖尿病酮症酸中毒及其他并发症；近期感染； 明确的心、肝、肺、肿瘤、外伤、风湿免疫性疾病；妊娠 期及哺乳期。 １．３ 方法 件进行分析，计量资料均以 ±ｓ表示，组问数据比较 用ｔ检验，相关分析采用直线相关分析方法，以 Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。 １．３．１研究方法：研究对象测量血压以及人体参数 查 鲎 ２年６月第３４卷第６期 ６８７ ２结果 ＴＧ、ＨＤＬ、ＬＤＬ差异无统计学意义（Ｐ＞Ｏ．０５）。见表３。 ＤＮ组ＵＡＥＲ（１４５±５．８４）ｌａ￣ｍｉｎ。ＮＦ—ＫＢ ｏ６５相 ＤＮ组外周血ＮＦ一．ｃＢ ｏ６５水平和血清炎症因子 ｈｓ—ＣＲＰ、＇Ｉ￣ｑＴ－ＯＬ、ＩＬ－６、ｍ－ｌｌ３水平比ＮＣ组升高（Ｐ＜Ｏ．（１５）， 见表２。ＤＮ组ＦＢＧ、ＰＢＧ、ＨｂＡｌｃ、ＦＩＮＳ、ＨＯＭＡ—ＩＲ与 ＮＣ组比较差异有统计学意义（Ｐ＜０．０１），两组ＴＣ、 关影响因素分析，直线相关分析：ＮＦ—ＫＢ与ｈｓ—ＣｌＩＰ、 ＩＬ－６、ＦＢＧ、ＨｂＡｌ ｃ、ＨＯＭＡ—ＩＲ、ＵＡＥＲ正相关（ｒ＝０．７７０、 ０．５７６、０．９２０、０．９５３、０．９１１、０．８５９，Ｐ均＜０．Ｏ１）。 表２两组炎症因子水平比较（ －Ｉ－ｓ） 相关，提示血清炎症因子ｈｓ－ＣＲＰ、ＩＬ－６在ＮＦ—ＫＢ炎症通 ３讨论 路的活化中发挥作用。 有关早期ＤＮ老年患者外周血ＮＦ—ＫＢ活化的相关 胰岛素代谢障碍导致的长期高血糖是ＤＮ发生的 因素报告较少。王蜀鄂等 报告糖尿病大鼠肾组织中 最关键的因素。高血糖造成的肾脏血流动力学改变、 ＮＦ－ＫＢ的表达及ＵＡＥＲ显著升高，肾组织中ＮＦ．ＫＢ表达 糖代谢异常所致的一系列后果与遗传因素相互作用是 量与ＵＡＥＲ呈正相关关系。隋雷等 报告不同糖耐量 造成肾脏病变的基础，众多炎症介质、细胞因子被激活 者外周血ＮＦ—ＫＢ活性随血糖水平增高而增高。本文相 则是病变形成的直接机制。近年来研究，ＮＦ．ＫＢ是一 关分析结果显示，早期ＤＮ老年患者外周血ＮＦ．ＫＢ活性 个具有多重效应的炎症转录因子，在糖尿病、蛋白尿等 与血糖水平、尿白蛋白排泄率呈正相关关系，提示高血 条件刺激下，其活化可促进炎症因子（ＴＮＦ一 、ＩＬ－６、 糖 、尿白蛋白也是上调ＮＦ—ＫＢ的因素。 ＩＬ一１Ｂ等）和黏附分子等表达，肾组织单核、巨噬细胞浸 胰岛素抵抗（ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，ＩＲ）是指胰岛素的 润，引起组织炎症及纤维化，ＮＦ．ＫＢ表达上调，促炎因子 外周靶组织（主要为骨骼肌、肝脏和脂肪组织）对内源 表达，肾间质损伤明显，炎症细胞浸润，激动后的ＮＦ—ＫＢ 性或外源性胰岛素的敏感性和反应性降低，导致生理 在ＤＮ的整个进展过程中也许是关键因素 Ｊ。本研究 剂量的胰岛素低于正常的生理效应。ＩＲ产生的高胰岛 结果表明，ＤＮ组外周血ＮＦ．ＫＢ ｐ６５的磷酸化水平以及 素血症直接作用于肾出球小动脉，导致肾小球高滤过、 血清炎症因子ｈｓ—ＣＲＰ、ＴＮＦ—ＯＬ、ＩＬ－６、ＩＬ一１Ｂ水平且均高 高灌注，造成肾脏损伤；胰岛素通过影响血管紧张素间 于ＮＣ组（Ｐ＜０．０５），表明老年２型糖尿病肾病早期患 接改变肾小球血流动力学，使肾小球内压增高，同时降 者存在ＮＦ—ＫＢ信号传导途径的激活和持续高表达。胰 低肾近曲小管对白蛋白的重吸收，使尿白蛋白排出增 岛素抵抗以及胰岛素分泌不足引起的高血糖均可以促 多。ＩＲ往往伴随有ＮＦ—ＫＢ活性升高 以及炎症因子 进胰岛细胞分泌大量的ＩＬ－６及ＴＮＦ一仪，ＩＬ－６、ＴＮＦ－ＯＬ作 如ｒｒＮＦ一仪、ｈｓ—ＣＲＰ、ＩＬ－６等水平升高 ，炎症因子 用于肝脏使ＣＲＰ增加。ＣＲＰ在正常人血液中以微量形 ＴＮＦ一仅、ＩＬ－６、ＩＬ一１Ｂ可通过ＩＫＫ／ＮＦ—ＫＢ、Ｃ－Ｊｕｎ氨基末 式存在，其水平变化可反映炎症反应的程度并衡量炎 端激酶通路、细胞因子信号抑制物通路等系统的活化 症对组织免疫损伤的程度。在ＤＮ形成过程中，ＩＬ－６、 干扰胰岛素的信号传导，引起和加速肾脏疾病的发生 ＩＬ一１Ｂ、ｒＩＮＦ— 、ＣＲＰ升高 ，均可能导致ＮＦ—ＫＢ激活，而 和发展。ＩＲ水平、ＮＦ—ＫＢ活性在ＤＮ不同阶段，随病情 升高ＮＦ—ＫＢ又导致炎症状态放大。相关分析显示：老 进展，逐渐增高 。本研究结果显示，ＮＦ—ＫＢ与ＩＲ 提示胰岛Ｂ细胞衰竭可能与炎症有关， 年ＤＮ早期患者外周血ＮＦ．ＫＢ活性与ｈｓ—ＣＲＰ、ＩＬ－６正 呈正相关关系，