西１１２２ 南农业学报 ２０１１年２４卷３期 Ｖ０Ｌ２４ Ｎ仉３ ￣ｕｔｈｗｅｓｔ Ｃｈｉｎａ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｅｉｅｎｅｅｓ 文章编号：１００１—４８２９（２０１１）０３—１１２２—０４ 广西奶水牛结核病三种检测方法的比较 谢志勤 ，谢芝勋Ｈ，刘加波 ，庞耀珊 ，邓显文‘，谢丽基 ，温娟 ，张振荣。，黄海强。 （１．广西兽医研究所，广西南宁５３０００１；２．广西南宁市动物疾病预防诊断中心，广西南宁５３０００１；３．广西武宣动物疾病预防 诊断中心，广西武宜５４５９００） 摘要：应用牛结核变态反应、ＰＣＲ和分离培养３种方法，对奶水牛进行牛结核病检测，比较３种检测方法的符合率。结果表明， １８５０头奶水牛中有７８头奶水牛的皮内变态反应结果为阳性，而对变态反应阳性的牛样品进行ＰｃＲ检测和分离鉴定，分别鉴定出 ４份和２份牛分技杆菌。阳性检出率以变态反应为最高（４．２２％），ＰＣＲ和分离鉴定的较低，分别为０．２１％和０．１ｌ％。交态反应 与ＰＣＲ检测、分离鉴定的符合率较差。而ＰＣＲ检测与分离鉴定的符合率相对较接近。因此建议．在对奶水牛群进行结核病检测 时，应先以变态反应检疫牛群，再结合ＰｃＲ检测进行综合诊断。更有利于奶水牛结核病的检测与净化。 关键词：奶水牛；牛结核病；变态反应；ＰＣＲ检测；分离鉴定 中图分类号：￥８５８．２３ 文献标识码：Ａ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｈｒｅｅ ｂｏｖｉｎｅ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｉｌｋ Ｂｕｆｆａｌｏ ＸＩＥＺｈｉ．ｑｌｎ ，ＸＩＥ Ｚｈｉ．ｘｕｎ¨，ＬＩＵ Ｊｉａ－ｏｂ ，ＰＡＮＧＹｅａ．ｓｌｕｍ ，ＤＥＮＧＸｉａｎ－ｗｅｎ ．ＸＩＥ Ｌｉ－ｊｉ 。ＷＥＮ Ｊｕａｎ２，ＺＨＡＮＧＺｈｅｎ－￣ｏｎｐ，ＨＵＡＮＧＨａｉ－ｑｉａｎ （１．Ｇｕａｎｇｘｉ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｇｕａｎｇｘｉ Ｎａｎｎｉｎｇ５３０００１。Ｃｈｉｎａ；２．Ｎａｎｎｉｎｇ Ａｎｉｍａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｃｅｎｔｅｒ．Ｃｕ￣ｘｉ Ｎａｎ・ ｎｉｎｇ５３０００１，Ｃｈｉｎａ；３．ＷｕｘｕａｎＡｎｉｍａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｃｅｎｔｅｒ＂，Ｇｕａｇｎｘｉ Ｗｕｘｕａｎ５４５９００，Ｃｈｉａ） ｎＡｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｔ ｓｔｕｄｙ ｗａ８ ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ ｔｏ ｄｅｔｃｔｅｄ ｂｏｙ／ｅｈｅ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ ｂｙ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ａｌｌｅｒｇｙ ｔｅｓＩ（ＡＴ），ｐｏ】ｙＩｎ ｎ ｃｈａｉｎ ｒｅ・ ａｃｔｉｏｎ（ＰｃＲ）．ａｎｄ ｉｓｏｌａｔｅ ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｍｉｌｋ ｂｕｆｆａｌｏｅｓ ｗｈｉｃｈ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂｙ ＡＴ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ７８ ｏｕｔ ｏｆ １８５０ ｓａｍｐｌｅｓｆｒｏｍｍｉｌｋ ｂｕｆｆａｌｏｓｗｅｒｅ ｄｅｔｃｔｅｄ ｐｏｓｉｅｔｉｖｅ ｂｙＡＴ．Ｆｏｕｒａｎｄ２Ｍｙｃｏｂａａｅｒｉｕｍ ｂｏｒｉｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂｙｍｅｔｈｏｄ ｏｆＰｃＲ ａｎｄ ｉｓｏｌａｔｅ ｃｕｌｔｕｒｅ。ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒａｔｅｆｏｒｔｈｅ ｂｏｖｉｎｅｔｕｂｅｒｃｕ／ｏｓ／ｓ ｏｆｔｈｅＡＴ，ＰＣＲ，ａｎｄｉｓｏｌａｔｅ ｅｕｌｔｕｎ￣ｗｅｒｅ４．２２％，０．２１％，ａｎｄ ０．１１％。ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅｃｏｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ｒａｔｓ ｏｆＡＴｗｉｅｔｈ ＰＣＲａｎｄｉｓｏｌａｔｅ ｃｕｌｔｕｒｅｗｅｒｅｗｏｌｆｅ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｃｏｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ｒａｔｅ ｂｅｔｗｅｅｎｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ＰＣＲ ａｎｄ ｉｏｌｓａｔｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｗａｓ ｓｉｍｉｌ￣．Ｉｔ ｗａＢ ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ ｔｈａｔ ｑｕａｒａｎｔｉｎｉｎｇ ｂｏｖｉｎｅ ｔｕｂｅｒｅｕｌｏｓｉｓ ｂｙ ｍｅｔｈｏｄ ａｌｌｅｒｇｙ ｔｅｓｔ ｌｉｆｎｔ．ｔｈｅｎ ｄｉａｇｎｏ－ ｓｉｎｇ ｂｙ Ｐ（ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｗｅｒｅｂｅｔｔｅｒｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄ ｐｕｒｉｉｃａｔｆｉｏｎ ｏｆｂｏｖｉｎｅｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｍｉｌｋ ｂｕｆａｌｏ；Ｂｏｙ／ｈｅ ｔｕｂｅｒｃｕ／ｍ／ｓ；Ｓｋｉｎ ａｌｌｅｒｇｙ ｔｅｓｔ（ＡＴ）；Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｏ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）；Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ 牛结核病主要是由牛结核分枝杆菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅ－ ｒｉｕｍ ｂｏｖｉｎｅ）引起的一种慢性进行性传染病¨ Ｊ。近 展中国家仍有流行，我国尽管采取了“检疫、捕杀” 的防制策略，但仍未能从根本上控制牛结核病 ｊ， 年来，随着结核分枝杆菌耐药菌株的产生及养牛业 的发展，牛结核病阳性检出率也呈逐年上升趋势，每 年给畜牧业生产造成巨大损失，目前世界范围内有 ５０００万头牛感染了结核病。每年造成的经济损失达 ３０亿美元【３ Ｊ。牛分枝杆菌还可以传染给人类，危害 人类健康。据报道，人结核病患者中约有３０％是由 其阳性检出率仍在ｌＯ％左右。 目前，已有多种不同的牛结核病检测诊断方法， 如变态反应、分离鉴定、ＥＬＩＳＡ【６ Ｊ、ＰＣＲ【１ 检测等。 应用较多的是传统诊断方法，即采用结核菌素皮试 （Ｔｕｂｅｒｃｕｌｉｎ ｓｋｉｎ ｔｅｓｔ，’Ｉ ）检测，通过皮下注射牛分 枝杆菌的纯化蛋白衍生物（Ｐｕｒｉｉｆｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｆｉｖａ— 是近几年发展起来的一种快速检测方法。在疾病诊 断方面得以广泛应用。虽然检测牛结核病的方法多 种多样，但尚未对各检测方法准确性进行比较。为 此，本研究通过应用牛结核变态反应、分离鉴定和 ＰＣＲ检测３种方法对牛群进行检测比较，明确这３ 种检测方法的优缺点及在实际工作中的应用价值， ｉｖｅ，ＰＰＤ），造成迟发性变态反应而进行判断。ＰＣＲ 生缱核 枝杆菌引起 】。目前，牛结核病在广大发 ｆ收稿日期：２０１０—０６—０４ 基金项目：新世纪百千万人才工程国家级人选专项基金项目 （９４５２００６０３）；国家农业公益性专项项目（２００８０３０２６）；广西科 技攻关项目（挂科转０６２６００１－５・１）；广西水产畜牧局科研计划项 目（桂渔牧科［０８】２８３－２０，桂渔牧科０９２５４一ｌ８） 作者简介：谢志勤（１９６５一），男，广西苍梧人，副研究员 主要从 事畜禽传染病分子生物学研究工作。・为通讯作者，Ｅ．ｍａｉｌ： ｘｉｅ－Ａｉｘｕｎ＠１２６．ｃｏｉｆｎ。 ３期 谢志勤等：广西奶水牛结核病三种检测方法的比较 以找出结核病污染群的最佳防治和净化方法，为更 好地防制牛结核病及减少人类结核病感染提供科学 依据。 表１ 牛分枝杆菌的变态反应检测结果 ＴａｂｌｅＩ Ｃｏｍｐａｒｌｓｏ．ｗｉｔｈｆｏｕｒｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆＡＴｆｏｒ胍 地点 Ｐｌ ａｃｅ 检镄Ｉ头数 Ｎｏ．ｏｆｄｅｔｅｃｔｉｏｎ 变态反应数（ ）阳性率（％）ｓｉｔｉＰｏｒｅＮｏ．０ｆＡＴ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒａｔｅ １材料与方法 １．１试验材料 在广西南宁、武宣、来宾、武鸣、合浦等不同地方 的奶水牛场，随机挑选１８５０头奶水牛进行试验及采 样。牛结核菌素购自哈药集团生物疫苗有限公司 （原黑龙江省生物制品一厂），冻干型，批号为 ２００４０４，规格为５ ｍｌＪ瓶；牛分枝杆菌Ｃ６８０００１灭活 菌、牛分枝杆菌ＢＣＧ抗原购自中国兽医药品监察 所，牛分枝杆菌分离株ｍｔ ３５９由广西兽医研究所分 离保存。Ｔａｑ聚合酶、ｄＮＴＰｓ、ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ购自宝生 物工程（大连）有限公司；蛋白酶Ｋ购自德国Ｍｅｒｋｅｒ 形状、大小等生长情况。 １．５涂片镜检及鉴别培养 将可疑菌落用萋一尼氏抗酸染色法染色，镜检， 将鉴定为分枝杆菌阳性菌株，转管至Ｌ－Ｊ氏培养基 进行纯化培养。然后用灭菌ＰＢＳ洗下来，按Ｉ：１００ 公司；十二烷基磺酸钠（ＳＤＳ）购自美国Ｐｒｏｍｅｇａ公 司；其他试剂均为进口或国产分析纯。改良罗氏培 倍稀释，分别接种于Ｔ２Ｈ培养基和ＰＮＢ培养基。 １．６ ＰＣＲ检测 养基（Ｌ—Ｊ氏培养基）按结核病细菌学常规技术进行 配制，ａ一羧酸肼噻吩（Ｔ２Ｈ）、对硝基苯甲酸（ＰＮＢ）鉴 别培养基由广西疾病控制中心结核病科惠赠。 １．２牛结核变态反应试验及判定标准 按规程ＧＢ／Ｔ １８６４５－２００２进行牛结核变态反应 根据基因库牛分枝杆菌特异性基因（登录号 ＭＢＵ８７９６１，￣９９５４０８８）设计１对牛分枝杆菌引物， 上游引物ＸＺｍｂｓｓ５：５：Ｃ ｒＣ１℃ＡＡ Ａ１－Ｉ℃ＧＣＣ１℃ＴＧ— ＴＡＧ－３ 下游引物ＸＺｍｂｓｓ６：５：ＴＣＣＧＴＣ．Ｉ．ＧＣＡＣＡＣＣＴ． 试验，并按其标准进行判定。 １．３临床样品的采集及预处理 用灭菌棉拭子从奶水牛鼻腔中挑取鼻粘液，然 后用经高压灭菌的ＰＢＳ将鼻粘液从棉拭子中洗下 来；淋巴结处理按１：５（Ｗ／Ｖ）加灭菌ＰＢＳ进行研 磨。分别取１．５ ｍＬ上述的鼻粘液洗液、淋巴结研磨 液和牛奶样品，置于１．５ ｍＬ离心管中。１２ ０００ ｒ／ｒａｉｎ ＴＣＴ ＧＣ．３，ｏ引物由宝生物工程（大连）有限公司合 成，预期扩增片段大小为６３１ ｂｐ。按谢芝勋等【ｓ 报 道的方法进行处理和提取核酸ＤＮＡ。反应程序为： ９４℃预变性５ ｒａｉｎ；９４℃１ ｒａｉｎ，５６℃１ ｒａｉｎ，７２℃１ ｒａｉｎ，进行３５个循环；７２℃延伸１０ ａｒｉｎ，最后于４℃ 结束反应。 ２结果与分析 ２．１变态反应检测结果 离心１０ ｍｉｎ，弃上清，沉淀用灭菌ＰＢＳ离心洗涤２ 次，保存备用。 １．４分离培养 根据牛变态反应国家标准进行判断，结果表明， 从１８５０头奶水牛检测出阳性水牛７８头，阳性 率为４．２２％（表１），其中广西南宁奶水牛的阳性检 出率为３．８９％（２８／７２０），武宣奶水牛的阳性检出 将已处理的鼻粘液洗液、淋巴结研磨液和牛奶 样品分别接种于Ｌ－Ｊ氏培养基，接种后置３７℃温箱 平放培养，３ ｄ后直立继续培养，观察菌落的颜色、 表２牛分枝杆菌的定型鉴定结果 Ｔａｂｌｅ ２ Ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ ０ｆ尬御 阱６Ｄ 注：“＋”表示细菌在培养基上生长，。一”表示细菌在培养基上不生长。 １１２４ 而南农业学报 ２３卷 ３讨论 本研究结果表明，皮内变态反应的阳性检出率 为４．２２％，分离鉴定的阳性检出率为０．１１％，ＰＣＲ ６３１ ｂｐ 的阳性检出率为Ｏ．２２％，变态反应的阳性检出率远 Ｍ：１００ ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ；１：牛分枝杆菌０５８００１；２：阴性对照；３：分 离株ｍｒ３０４；４：分离株ｒｏｔ３７０；５：分离株ｍｔｌ２０；６：分离株ｍｔｌ８ 高于分离鉴定和ＰＣＲ检测。这是由于：①与结核变 态反应的特异性差有关。张喜悦 和Ｌｏｄｅｓ 等【】训报道牛结核变态反应易受人为因素的影响和 非典型分枝杆菌感染及患有寄生虫病等非特异性因 图１分离株ＰＣＲ检测结果 Ｆｉｇ．１ Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｆｏｒｉｓｏｌａｔｅ ｓｔｒａｉｎｓ 素的干扰。本研究从变态反应阳性的７８份样品中 只分离出ｌ３株菌株，且证实ｌ３株菌中有１１株为非 典型分枝杆菌，说明非典型分枝杆菌的存在可以影 响变态反应的检测结果，造成假阳性，这与张喜悦 率为５．１４％（１８／３５０），来宾奶水牛的阳性检出率 为３．５０％（７／２００），合浦奶水牛的阳性检出率为４． ０ｏ％（２０／５０Ｏ），武鸣奶水牛的阳性检出率为６．２５ ％（５／８０）。 ２．２牛分枝杆菌分离鉴定结果 对７８份结核变态反应阳性样品进行结核分枝 杆菌分离培养，共分离获得ｌ３株菌株，经萋一尼氏抗 酸染色法染色后，镜检鉴别，确定有２株为牛分枝杆 菌，其余均为非典型分枝杆菌，结果见表２。 ２．３ ＰＣＲ检测结果 等［９ 和Ｌｏｄｅ８等【１ｏＪ的报道结果一致。②检测牛处 于牛结核发病初期或隐性期，处于细胞免疫期。③ 与奶水牛的皮厚有关，由于奶水牛的皮较黄牛、黑白 花奶牛的厚，对结核菌素刺激要比黄牛、黑白花奶牛 敏感，应用现有牛的判定标准来判定，可能会导致阳 性率过高。 本研究中，变态反应与分离鉴定的符合率很低， 只有２。５６％。这是由于结核分枝杆菌是胞内寄生 以ＰＣＲ方法鉴定７８份结核变态反应阳性样 品，结果表明，有４份为牛分枝杆菌阳性，其中包含 菌，受机体机能影响，当机体抵抗力较强时，了 结核菌在体内的增殖、扩散，此时以细胞免疫为主； 当机体抵抗力弱时，病原体向周围扩散，进入血液和 体液中，病原体刺激机体产生大量抗体¨¨，此时应 以检测病原为主。变态反应主要是针对细胞免疫期 进行检测Ｌ１引，而分离鉴定是针对病原的鉴别检测， 了２份分离出牛分枝杆菌的样品。而对分离获得的 ｌ３株菌株进行ＰＣＲ鉴定，发现原鉴定为牛分枝杆菌 株的２株菌株的ＰＣＲ检测结果仍为阳性，其余菌株 则为阴性，结果见图１。 ２．４变态反应、分离鉴定与ＰＣＲ检测方法的比较 由表３可以看出，对１８５０头奶牛进行变态反应 试验，阳性检出率为４．２２％（７８／１８５０）；从７８头检 测阳性样品中分离鉴定获得２株牛分枝杆菌，阳性 分离率为２．５６％（２／７８），占全群的０．１１％（２／ １８５０）；ＰＣＲ阳性检出率为５．１３％（４／７８），占全群 的０．２２％（４／１８５０）。变态反应、ＰＣＲ检测与分离 鉴定的符合率分别为２．５６％和５Ｏ．０ｏ％，说明变态 反应的阳性检出率远高于ＰＣＲ及分离鉴定的检出 因此变态反应与分离鉴定的符合率较低是合理的。 ＰＣＲ检测与分离鉴定的符合率也只有５０．０ｏ％，这 是由于ＰＣＲ是对牛分枝杆菌的病原核酸进行检测， 不管是活菌还是已死亡的分枝杆菌均能进行检测， 具有较高的敏感性【１ ；分离鉴定主要是对活体病原 进行体外增值并鉴定，对已死亡分枝杆菌无法应用 培养基进行分离，因此在实际的检测中，ＰＣＲ检测 与分离鉴定的符合率不一致也是正常。 本研究对３种牛结核病常用检测方法进行比 较，结果表明，变态反应检测虽然特异性差，但对于 率，但ＰＣＲ检测与细菌分离鉴定的检出率较接近。 表３变态反应、分离鉴定和ＰＣＲ检测的比较 Ｔａｂｌｅ ３ Ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｖｅ ｃｏｍｐａｒｉｏｎ ｓａｍｏｎｇＡＴ。ｉｓｏｌａｔｅｓ ａｎｄ ＰＣＲ ３期 谢志勤等：广西奶水牛结核病三种检测方法的比较 ｌ１２５ 检测早期或刚感染牛结核病的牛起到很大的作用， 可以减少检测的盲目性；分离鉴定虽然是最准确的 一ｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｅｌｅｃｕｏｐｏｒａｔｉｏｎ：ａ ｎｏｖｅｌｍｅｔｈｅｄ ｆｏｒ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ０ｆ ｆａｎｎｅｄ ｕｒｍｉｎａｎｔｓ［Ｊ］．Ｓｃａｎｄｉａｖｎｉｎ ａＪｏｕｒｎａｌ ｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００３，５７（３）： ２２９—２３８． 种诊断方法，但具有一定的局限性，对样品要求 【６］徐凤宇。高云航，何昭阳．ＥＬＩＳＡ检测乳中牛结核抗体的研究 【Ｊ】．黑龙江畜牧兽医。２００６（３）：７２—７３． ［７］刘思国，王春来，官８３． 高，存在鉴定周期长、繁琐、易受人为或其他环境因 ：素影响等缺点，不利于对牛结核病进行快速检测；而 应用ＰＣＲ检测牛结核病，不但可以提高检测的准确 性，还可以实现快速检测，在实际中可作为皮内变态 反应检测的补充。因此，在对牛群进行牛结核检测 强，等．牛分枝杆菌特异性ＰＣＲ检测方法 的建立及初步应用［Ｊ］．中国预防兽医学报，２００６，２８（１）：８０— ［８］谢芝勋，谢志勤。雷剑明。等．结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的二重 ＰｃＲ快速检测［Ｊ］．中国人兽共患病学报，２００８，２４（１２）：ｌ１４１一 时，应首先进行变态反应检测，并根据检测结果即时 采取隔离措施，然后结合ＰＣＲ检测进行综合诊断， 两者检测均为阳性的牛应及时淘汰，最终起到净化 牛结核病的作用。 参考文献： ［１】雷剑明。谢芝勋，谢志勤，等．牛分枝杆菌广西分离株ＣＦＰ－１０、 ＥＳＡＴ－６、ＭＦＢＴ０基因的克隆与序列分析［Ｊ】．广西农业科学 ２００９。４０（９）：１２２９—１２３３． ［２】谢志勤，谢芝勋，刘加波，等．牛分枝杆菌广西分离株ＥＳＡＴ－６基 因鉴定及遗传进化分析［Ｊ］．广西农业科学２０１０，４１（８）：８２７— ８３０． ［３］余大海，韦一然，蔡宏，等．牛结核病鉴别诊断的方法研究 ［Ｊ］．中国人兽共患病学报，２００６，２２（１０）：９３２－９３５． 【４］Ｄｙｅ Ｃ Ｄ。Ｓｃｈｅｅｌｓ ＳＭ ｓ，Ｄｏｌｉｎ ＰＤ。ｅｔａ１．Ｇｌｏｂａｌ ｂｕｒｄｅｎ ｏｆｔｕｂｅｒｃｕ－ ｌｏｓｉｓ ｅｓｔｉｍａｔｅｄ ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ，ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ，ａｎｄ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ｂｙ Ｃｏｕｎｔｒｙ【Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａ￣ｅｏｃｌａｔｉｎｏ，１９９９，２８２（７）：６７７— ６８６． ［５］Ｔｏｌｌｅｆｓｅｎ Ｓ，Ｖｏｄｒｅｒｍｅｉｅｒ Ｍ。Ｕｌｓｅｎ Ｉ。ｅｔ １ａ．ＤＮＡ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｃｏｍｂｉ． ｌ１４４． ［９］张喜悦，王君玮，高云航，等．３种方法检测结核污染牛场的比较 ［Ｊ】．中国兽医学报。２００３，２３（６）：５５５—５５６． ［１０］Ｌｏｄｅｓ Ｍ Ｊ，Ｄｉｌｌｏｎ Ｄ ｃ，Ｍｏｈａａｍｔｈ Ｒ，ｅｔ ８１．Ｓｅｒｅｌｏｇｉｅｌａ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ＭＴＢ４８，ａ ｎｏｖｅｌ＾ｆ】∞６口ｄ 册ｔｕｂｅｎ＇ｕｌｏａｉａａｎｔｉｇｅｎ［Ｊ］．Ｊ Ｃｌｉ Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌ，２００１．３９（７）：２４８５— ２４９３． 【Ｉｌ】Ｅ咖ｅ咖ｌＡ，Ｄｅｌｅｕ Ｓ．Ｃａｔｔｌｅｔｏｂｅｎｍｌｓｅｉｓ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ∞６口 ｍ ｂｏｄｎｅｉｓ ｄｉｆｉｃｕｌｔｔｏ ｄｅｔｅｃｔａｎｄｔＯｔｌ＇ｅａｔ［Ｊ】．Ｖｅｅｈｎｏｄｅｅｒｎ Ｄｉｅｅｒｎａｒ－ ｔｓ。２０００，１４（２）：４２７． 【１２］Ｍｉｌｌｅｒ Ｊ Ｍ，Ｊｅｎｎｙ Ａ Ｌ，Ｐａｙｅｕｒ Ｊ Ｂ．Ｐｏｌｙｍｅｍｓｅ ｃｈａｉｎ ｌｅａｃｔｉｏｎ ｄｅ－ ｔｃｅｔｉｏｎ ｏｆＭ ∞ｋｃ ｕｍｔｕｂｅｍｕ／ｏｓ／ｓ ｃｏｍｐｌｅｘａｎｄＭｙｃｏｂａａｅｄｕｍ ａｒｉ－ ｕｍｏｒｇａｎｉ￣ｍｓ ｉｎ ｆｏｒｍａｌｉｎ－ｉｆｘｅｄ ｔｉｓｓｕｅｓ ｆｍｍ ｃｕｌｔｕｒｅ－ｎｅｇａｔｉｖｅ ｒｕｍｉｎａｎｔｓ ［Ｊ】．Ｖｅｔ．Ｍｉｃ￣ｏｂｉｏ１．，２００２，８７（１）：１５－２３． ［１３］谢芝勋，谢志勤，刘加波，等．多重ＰｃＲ快速检测鉴别牛布鲁氏 菌和牛分枝杆菌的研究与应用【Ｊ］．中国人兽共患病学报， ２００７，２３（７）：７１４－７１６． （责任编辑兰宗宝）
