高效液相色谱法检测人参培养须根及内生菌中皂苷的含量

高效液相色谱法检测人参培养须根及内生菌中皂苷的含量

作者：肖丹 杨洪岩 吴昊

来源：《安徽农业科学》2014年第17期

摘要 [目的]检测人参培养须根及内生菌中皂苷的含量。[方法]采用高效液相色谱法同时测定植物生物反应器中人参培养须根及内生菌中10种人参皂苷单体的含量。液相体系为：Waters Symmetry C18 Synergi色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱温30 ℃，以乙腈为流动相A，超纯水为流动相B进行梯度洗脱，检测波长203 nm，进样量10 μl。[结果]10种皂苷基本分离，线性关系良好，稳定性、精密度和重复性均较好，平均回收率在95.07%～108.72%。[结论]该方法快速简便，重现性好，可对人参培养须根及内生菌中皂苷含量进行多指标质量控制。

关键词 人参培养须根；内生菌；人参皂苷；皂苷含量测定；高效液相色谱法 中图分类号 S567 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）17-018-04

Abstract [Objective] To measure the ginsenosides content in ginseng cultivation fibrous and

endophytes. [Method] High Performance Liquid Chromatographic（HPLC）method was used for the simultaneous determination of 10 kinds of ginseng saponin monomer in plant bioreactors of ginseng root and ginseng endophytes. The chromatographic separation was performed on a Water Symmetry C18 Synergi column（250 mm×4.6 mm，5 μm）and the column temperature was set to 30 ℃， then let acetonitrile as the mobile phase A， B ultrapure water as the mobile phase to gradient elution， also we set the detection wavelength to 203 nm and the injection volume 10 μl. [Result] The results showed that we can basic separation of 10 kinds of saponins， and the linear relationship is good， also we can find that the average recovery range of 95.07% to 108.72%. [Conclusion] The method is simple， reproducible， ginsenosides content in ginseng root and ginseng cultivation endophytes can be controlled with multiindicators.

Key words Ginseng cultivation fibrous； Endophytes； Ginsenosides； Determination of saponin； High Performance Liquid Chromatographic method

人参（Panax ginseng C.A.Mey.）属五加科人参属多年生药用草本植物，是传统名贵中药。人参具有很高的药用价值，人参皂苷是其主要药效成分。现代药理学研究认为，人参不仅对中枢神经、心血管、免疫、内分泌系统等方面具有药理作用，还表现出抗肿瘤、抗应激、抗氧化活性和强劲的抗真菌活性[1]。由于人参的主要活性成分是人参皂苷，所以人参皂苷的含量一般被认为是评价人参内在质量的主要指标。

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关于人参皂苷测定的标准，2010年版的《中华人民共和国药典》[2]中规定以高效液相色谱法测定干燥样品含人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的总量不得少于0.30%，人参皂苷Rb1不得少于0.20%作为人参的质量标准。近年来根据该标准，已有不少关于测定人参药材及复方中人参皂苷的含量研究报道，如林世和等[3]通过建立新的HPLC方法来测定人参芦中人参皂苷Rb1、Rg1、Re的含量，许乾丽等[4]利用HPLC方法测定益心舒胶囊中的人参皂苷Rb1、Rg1、Re的含量，冯中等[5]则对不同厂家复方丹参片中三七皂苷R1和人参皂苷Re、Rg1、Rb1含量进行HPLC测定，而chen等[6]利用HPLC-MS对人参皂苷Rg1、Re进行快速分离提取及含量测定。但根据该标准所测定的人参皂苷成分比较单一，很难反映药材整体质量的优劣。也有对3种以上人参皂苷进行同时测定，只是分析时间较长，条件繁琐，有些皂苷也没有很好的分离出来[7-8]。人参皂苷Rb1、Rb2、Re、Rd、Rc、Rf、Rg1、F2、Rg3、Rh2为人参中的主要皂苷类成分，具有重要的药用价值。如果能够摸索出一个同时测定这10种人参皂苷单体的HPLC体系，将对评价产物人参皂苷质量具有重要促进作用。

项目组一直以来进行利用人参培养须根和内生菌生产人参皂苷的课题。因此笔者开发了一组同时测定上述10种人参皂苷含量的液相体系，利用该体系对生物反应器培养的人参培养须根及内生菌生产人参皂苷[9]进行分析，达到很好的定性定量效果，以期为人参培养须根及内生菌中人参皂苷质量进行多成分指标综合评价提供技术参考。 1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 研究对象。不同批次的人参初代培养根，为韩国江原道野生山参（Panax ginseng C.A.May.）的须根（韩国江原大学山林科学学院崔龙义教授鉴定）诱导而来，继代用无菌培养须根由东北林业大学生命学院由香玲教授提供。

1.1.2 主要仪器。Waters e26952998液相色谱系统，购自Waters公司；DHAUS AR2140电子天平和FW135中草药粉碎机，购自天津市泰斯特仪器有限公司；N-1001旋转蒸发仪，购自上海爱朗仪器有限公司。

1.1.3 主要试剂。人参皂苷Rb1（41753439，HPLC≥98%）、Rb2（11021139，HPLC≥98%）、Re（5125，HPLC≥98%）、Rf（52286585，HPLC≥98%）、Rg1（22427390，HPLC≥98%）、F2（620294，HPLC≥98%），Rh2（1117 200601，

HPLC≥98%），Rc（11021140，HPLC≥98%），Rd（52705938，HPLC≥98%），Rg3（110804-200603，HPLC≥98%）对照品，均由中国药品生物制品检定所提供。乙腈为色谱纯（DIKMA），水为超纯水，甲醇为色谱纯（DIKMA），市售。 1.1.4 供试菌种。G22[9]，由实验室从龙牙楤木提取获得的内生菌。 1.2 方法

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1.2.1 色谱条件。色谱柱为Waters Symmetry C18 Synergi（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温为30 ℃；以乙腈为流动相A，超纯水为流动相B，按表1中的规定进行梯度洗脱；检测波长为203 nm；进样量为10 μl。

1.2.2 对照品溶液的制备。精密称取适量人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd、F2、Rg3、Rh2对照品，加浓度100%甲醇稀释制得浓度0.2 mg/ml的人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd、F2、Rg3、Rh2的混合对照品溶液。

1.2.3 方法学考察。（1）系统适应性试验。取适量对照品溶液、供试品溶液和G22溶液，按上述色谱条件进样，测定系统适用性。（2）线性关系的考察。精密称取对照品适量制成混合对照品溶液，分别精密吸取对照品溶液10、20、30、40和50 μl进样测定，以含量值X为横坐标，峰面积积分值Y为纵坐标，绘制标准曲线，计算线性回归方程。（3）试验精密度。精密吸取上述对照品溶液10 μl，连续进样6次，记录峰面积，根据所得峰面积考察精密度。（4）试验重复性。精密称取6份同一批次人参药材样品各1.000 g，制备6份供试品溶液，按上述色谱条件分别进行进样测定，计算各成分含量和RSD。（5）试验稳定性。精密称取同一供试品溶液，在上述色谱条件下分别于0、2、4、6、8、12和24 h进样测定，计算人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd、F2、Rg3、Rh2峰面积的RSD。（6）试验回收率。精密量取已知含量的供试品溶液0.8 ml，精密加入 “1.2.2” 项下混合对照品溶液0.8 ml，摇匀。平行制备6份供试品溶液，并按上述色谱条件进行进样测定。计算人参皂苷的平均回收率和RSD。

1.2.4 人参培养须根皂苷的提取。（1）干燥。将收获的人参培养须根放入烘箱中干燥，温度设置为50 ℃。（2）粉碎。将干燥后的材料放入中草药粉碎机中打成粉末状，并在电子天平上精确称取1.000 g。（3）萃取。称取后的材料置于50 ml离心管中，精密加入25 ml浓度80%的甲醇，盖严，超声萃取（65 ℃，100 HZ）50 min，每10 min晃动摇匀一次，取上清液，转移上清液至新的离心管。向底物中重新加入25 ml甲醇重复萃取1次，合并上清液。（4）离心。高速离心5 min（3 000 r/min），取上清液进行蒸发。（5）蒸发。用旋转蒸发仪（80 ℃，80 r/min）旋转蒸发提取液提取皂苷。（6）过滤。得到的干燥物用2 ml浓度20%的乙腈溶解，摇匀，用一次性过滤器滤过，取滤液，该滤液即为供试品溶液。

1.2.5 内生菌G22皂苷的提取。（1）萃取：将25 ml菌液置于50 ml离心管中，精密加入25 ml浓度100%的乙酸乙酯，盖严，超声萃取（65 ℃，100 hz）50 min，每10 min晃动摇匀1次，取上清液，转移上清液至新的离心管。向底物中重新加入25 ml乙酸乙酯重复萃取1次，合并上清液。（2）离心。高速离心5 min（3 000 r/min），取上清液进行蒸发。（3）蒸发。用旋转蒸发仪（80 ℃，80 r/min）旋转蒸发提取液提取皂苷。（4）过滤。得到的干燥物用2 ml浓度20%的乙腈溶解，摇匀，用一次性过滤器滤过，取滤液，该滤液即为供试品溶液。 1.2.6 样品测定。按上述供试品的制备方法和色谱条件，测定不同批次人参培养须根样品和内生菌G22中人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd、F2、Rg3、Rh2总量，重复3次。

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1.2.7 数据分析。所有生化分析数据均用Excel 2007进行数据处理和图表绘制，色谱图片由液相软件Empower 3直接截图而来。 2 结果与分析

2.1 方法学考察 （1）系统适应性试验。图1～3表明，对照品溶液和供试品溶液在相同的保留时间上有对应的吸收峰，且分离度良好，表明系统适应性良好。（2）线性关系的考察。由表2可知，在各自范围内，人参皂苷浓度与峰面积的线性关系良好。（3）试验精密度。计算得人参皂苷Rg1峰面积的RSD为2.24%，Re峰面积的RSD为1.32%，Rf峰面积的RSD为1.66%，Rb1峰面积的RSD为1.39%，Rc峰面积的RSD为1.28%，Rb2峰面积的RSD为1.33%，Rd峰面积的RSD为0.71%，F2峰面积的RSD为1.97%，Rg3峰面积的RSD为1.75%，Rh2峰面积的RSD为2.08%，表明仪器精密度良好。（4）试验重复性。计算得人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd、F2、Rg3、Rh2总量的含量平均值为7.71 mg/ml，RSD均小于3.0%，说明该方法重复性良好。（5）试验稳定性。计算得人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd、F2、Rg3、Rh2峰面积的RSD在0.71%～2.24%，表明该供试品溶液在24 h内稳定性良好。（6）试验回收率。由表3可知，各人参皂苷平均回收率均在95.07%～108.72%，RSD 3 讨论

3.1 指标的选择 研究表明，人参中有多种成分具有抗氧化、抗应激、抗肿瘤等活性，其中主要活性成分是人参皂苷。2008年发布的国家标准GB/T 22996-2008给定了6种人参皂苷单体的测量方法，这6种皂苷分别为人参皂苷Re、Rg1、Rf、Rb1、Rc、Rb2，而2010年中国药典给定了人参皂苷Rg1、Re、Rb1的测定方法。通常研究者们根据国家标准和自己研究的侧重点选取不同人参皂苷单体作为测量目标[8，10]。经过项目组对人参皂苷成份功能的分析，选取了10种人参皂苷来进行试验测定，分别是Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd、F2、Rg3、Rh2。人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd等是人参中人参皂苷的主要组成成分，具有不同的药理活性。其中人参皂苷Rg1和Rd对中枢神经类疾病具有良好的疗效[11-12]，人参皂苷Rb1和Rf在抗氧化、清除氧自由基、提高记忆力等方面有较强活性[13-14]，人参皂苷Rb2具有抗感染活性[15]；Re能降血糖、抗氧化等功能[14，16]，Rc能延长溶血发生的滞后时间[17]。稀有人参皂苷F2能够引起乳腺肿瘤干细胞凋亡[18]，Rh2、Rg3则具有抗肿瘤等活性[19-21]，在肿瘤治疗上表现出很高的应用价值，格外值得关注。

3.2 液相条件的选择 试验考察了无水甲醇-超纯水、乙腈-超纯水、浓度0.05%磷酸-乙腈等不同的梯度洗脱系统，发现乙腈-超纯水系统和0.05%磷酸-乙腈梯度洗脱效果要明显一些，而且由于乙腈黏度小，可以有效降低系统压力，虽然利用0.05%磷酸作为流动相B时能得出很好的峰形，但与以超纯水作为流动相B所出的峰形相差很小。所以，为了简便的测定，最终选用乙腈-超纯水系统梯度洗脱法进行分离。根据人参皂苷类成分最佳紫外吸收波长，设定HPLC体系的紫外吸收波长为203 nm。而在对柱温的选择是通过考察25、28和30 ℃时色谱峰的分离度，结果显示30 ℃时色谱峰分离良好，故色谱柱温选择30 ℃。

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选择合适的梯度是分离人参单体皂苷的关键，而由于Rg1和Re极性相似，所以Rg1和Re很难分离。有文献报道对它们进行分离试验，但分离时间长且条件繁琐，或是峰形不佳。如2008年版的《中国国家标准汇编》[7]是以高效液相色谱法测定生晒人参的人参皂苷Re、Rg1、Rf、Rb1、Rc、Rb2含量，且标准含量检出限除了人参皂苷Rf为25 mg/kg之外，其他人参皂苷Re、Rg1、Rb1、Rc、Rb2均为50 mg/kg。该方法测定的人参皂苷Rg1和Re保留时间太接近，相差只有0.239 min，而人参皂苷Rf与Rb1、Rb1与Rc保留时间分别相差0.296和0.23 min，不能很好的对这几种皂苷单体进行分离。而且该标准只是测定了6种人参皂苷，还有其他重要的人参皂苷没有进行测定。曹树萍等[8]利用HPLC法测定了参麦注射液中9种人参皂苷的含量，但该方法测定得出的液相图谱中各皂苷峰形不是很好，且Rg1和Re没有完全分离开来。试验色谱条件是在文献的基础上优化而成，在35～45 min，采用19%的乙腈梯度洗脱使人参皂苷Rg1和Re达到基本分离，所以试验的梯度洗脱条件能达到对Rg1和Re的分离目的。

试验对项目实验室中人参培养须根及内生菌G22中10种皂苷成分进行了含量测定，其结果符合《中华人民共和国药典》（2010年版）[2]中对Rg1、Re、Rb1含量测定的要求。研究表明人参皂苷试验的精密度、重复性、稳定性、回收率试验的范围均符合相关标准。结果表明，在研究介绍的高效液相色谱条件下分离的人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd、F2、Rg3、Rh2峰形良好，分离效果也比较理想。所以试验探索的研究方法快准确简便，稳定可靠，可以用来对人参药材及内生菌的产物皂苷进行质量控制。 参考文献

[1] 杨金玲，高丽丽，朱平.人参皂苷生物合成研究进展[J].药学学报，2013，48（2）：170-178.

[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].北京：中国医药科技出版社，2010. [3] 林世和，余南才，易艳东，等.HPLC法测定人参芦中人参皂苷Rb1、Rg1、Re的含量[J].中国药师，2010（4）：531-533.

[4] 许乾丽，茅向军，熊慧林.HPLC测定益心舒胶囊中人参皂苷Rg1，Re的含量[J].中国中药杂志，2005（18）：1462-1463.

[5] 冯中，李晓燕，刘波，等.HPLC测定不同厂家复方丹参片中三七皂苷R1和人参皂苷Re、Rg1、Rb1含量[J].中成药，2009（1）：71-74.

[6] CHEN F，LUO J，KONG L.Fast isolation of ginsenosides Re and Rg1 from the roots of panax ginseng by HSCCCELSD combined with MCI GEL CC guided by HPLCMS[J].Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies，2012，35（7）：912-923. [7] 中国标准出版社.中国国家标准汇编[G].北京：中国标准出版社，2008.

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[8] 曹树萍，聂黎行，王钢力，等.HPLC 法同时测定参麦注射液中9 个人参皂苷的含量[J].药物分析杂志，2011，31（3）：476-478.

[9] WU H，YANG H Y X.Isolation and characterization of saponinproducing fungal endophytes from Aralia elata in Northeast China[J].International Journal of Molecular Sciences，2012，13（12）：16255-16266.

[10] 赵亮，吕磊，纪松岗，等.高效液相色谱法快速测定人参中8种主要皂苷类成分的含量[J].第二军医大学学报，2008，29（12）：1507-1510.

[11] 张经纬，王广基，孙建国.人参皂苷Rgl的药效学和药代动力学研究进展[J].中国医科大学学报，2007（6）：283-288.

[12] 张琛，赵钢.人参皂苷Rd的药理作用研究进展[J].中国新药杂志，2011（11）：953-958.

[13] 石艳清，张静，朱元贵，等.人参皂苷Rb1 改善快速老化小鼠P8 学习记忆功能障碍[EB/OL].http：//www.paper.edu.cn/releasepaper/content/201103-131.

[14] CHOA W C S，CHUNG W S，LEE S K W，et al.Ginsenoside Re of Panax ginseng possesses significant antioxidant and antihyperlipidemic efficacies in streptozotocininduced diabetic rats[J].European Journal of Pharmacology，2006，550（1/3）：173-179.

[15] 李冬梅.人参皂苷Rb2体外抗感染研究[J].中华医院感染学杂志，2011（7）：1284-1286.

[16] 孟凡丽，苏晓田，郑毅男.人参皂苷Rb3对糖尿病模型小鼠的降血糖和抗氧化作用[J].华南农业大学学报，2013（4）：553-557.

[17] LIU Z Q，LUO X Y，SUN Y X，et al.Can ginsenosides protect human erythrocytes against free- rad icalinduced hemolysis？[J].Biochim Biophys Acta，2002，1572（1）：58-66. [18] MAI T T，MOON J，SONG Y，et al.Ginsenoside F2 induces apoptosis accompanied by protective autophagy in breast cancer stem cells[J].Cancer Letters，2012，321（2）：144-153. [19] WU N，WU G C，HU R，et al.Ginsenoside Rh2 inhibits glioma cell proliferation by targeting microRNA128[J].Acta Pharmacologica Sinica，2010，32（3）：345-353.

[20] HE B C，GAO J L，LUO X，et al.Ginsenoside Rg3 inhibits colorectal tumor growth through the downregulation of Wnt/βcatenin signaling[J].International Journal of Oncology，2010，38（2）：437-455.

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[21] ZHANG C，LIU L，YU Y，et al.Antitumor effects of ginsenoside Rg3 on human hepatocellular carcinoma cells[J].Molecular Medicine Reports，2012，5（5）：1295-1298.