脂肪酶水解鱼油富集DHA和EPA甘油酯的研究1

脂肪酶水解鱼油富集DHA和EPA甘油酯的研究

姓名：孙丽萍申请学位级别：硕士专业：水产品加工及贮藏工程

指导教师：章超桦

20060427

脂肪酶水解鱼油富集ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯的研究摘要天然鱼油中ＤＨＡ和ＥＰＡ一般是以甘油酯的形式存在，含量相对较低，保健和医疗效果比较差。而ＤＨＡ和ＥＰＡ的甘油酯型易被人体消化吸收，性质稳定，是保健品和药品的最佳产品型式。为增强ＤＨＡ和ＥＰＡ的保健和医疗效果，就须提高ＤＨＡ和ＥＰＡ在甘油酯中的含量。脂肪酶催化鱼油水解法是提高ＤＨＡ、ＥＰＡ在甘油酯中含量的一种很有效的方法。本研究通过采用单因素和响应面试验设计，得到脂肪酶ＯＦ水解鱼油的较好的工艺参数：在油水比为１：４、缓冲溶液ｐＨ值６．５、酶浓度２０ｍｇ／ｇ油、反应温度为３５℃的情况下水解２４ｈ后，产物中的ＤＨＡ和ＥＰＡ总含量可达６１．４８％，其中ＤＨＡ和ＥＰＡ含量分别为５６．２２％和５．２６％。ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯的理化性质符合鱼油的一级标准。ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯经硅胶柱层析分离和傅立叶近红外光谱检测，结果表明产物中以甘油二酯为主，含量为６４．３２％；其次是甘油三酯和甘油一酯，含量分别为３５．２３％和０．４５％。通过对脂肪酶催化鱼油水解反应动力学的研究，发现该反应在动力学控制条件下，基本符合Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ－Ｍｅｎｔｅｎ的单底物酶促反应动力学。通过对试验数据的回归分析，求得了酶促鱼油水解的动力学参数，米氏常数‰．：ｏ．４５ｍｏｌ／Ｌ，最大反应速‰。＝０．１５ｍｏｌ／Ｓ。差示扫描量热（ＤＳＣ）分析表明，ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯的热氧化过程与甘油酯组成及脂肪酸组成都密切相关：微商热重（ＤＴＧ）分析表明，ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯的热氧化过程主要发生在３００℃．５００℃，因此应当采取适当措旌避免ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯热氧化的发生。利用Ｆｌｙｎｎ．Ｗａｌｌ．Ｏｚａｗａ法和Ｋｉｓｓｉｇｅｒ法分别计算出了ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯的热氧化动力学参数，两种方法具有一致性。这都为预测ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯产品的货架期提供了可靠的理论依据。关键词：黄鳍金枪鱼鱼油，ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯，脂肪酶，水解Ｓｔｕｄｙ０１１ＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＤＨＡａｎｄＥＰＡＧｌｙｃｅｒｉｄｅｓｂｙＬｉｐａｓｅＨｙｄｒｏｌｙｓｉｓｏｆＦｉｓｈＯｉｌＡｂｓｔｒａｃｔＤＨＡａｎｄＥＰＡｅｘｉｓｔＤＨＡａｎｄＥＰＡｉｓｉｎｔｈｅｆｏｒｍｏｆｇｌｙｃｅｒｉｄｅｉｎｔｈｅｎａｔｕｒａｌｆｉｓｈｏｉｌ。Ｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｒｅｌａｔｉｖｅｌｙｌｏｗｅｒ，ＳＯｈｅａｌｔｈｃａｒｅａｎｄｍｅｄｉｃａｌｎａｔｕｒｅｅｆｆｅｃｔｓａｒｅｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｌｙｂａｄ，ＳｉｎｃｅＤＨＡａｎｄＥＰＡｇｌｙｃｅｒｉｄｅｓｗｉｔｌｌｓｔａｂｌｅｄｉｇｅｓｔｅｄａｎｄａｓｓｉｍｉｌａｔｅｄｂｙｔｈｅａｒｅｅａｓｉｌｙｈｕｍａｎｂｏｄｙ，ｔｈｅｙａｒｅｔｈｅｂｅｓｔｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆｈｅａｌｔｈａｎｄｍｅｄｉｃｉｎｅｓ．ＩｎｏｒｄｅｒｔｏｓｔｒｅｎｇｔｈｅｎｔｈｅｔｏｈｅａｌｔｈｃａｒｅａｎｄｍｅｄｉｃａｌｅｆｆｅｃｔｓｏｆＤＨＡａｎｄＥＰＡ，ｓｏｍｅｍｅａｓｕｒｅｓｍｕｓｔｂｅｔａｋｅｎＩｔｉｓａｉｍｐｒｏｖｅＤＨＡａｎｄＥＰＡｃｏｎｔｅｎｔｉｎｔｈｅｇｌｙｃｅｒｉｄｅｓ．ｋｉｎｄｏｆｖｅｒｙｅｆｆｅｃｔｉｖｅｍｅｔｈｏｄｂｙｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｎｇＤＨＡａｎｄＥＰＡｉｎｎａｔｕｒａｌｆｉｓｈｏｉｌｂｙｌｉｐａｓｅｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ．Ｔｈｅｂｅｔｔｅｒｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｐａｒａｍｅｔｅｒｓｈａｄｂｅｅｎｏｂｔａｉｎｅｄｂｙｔｈｅｒｅｓｐｏｎｓｅｓｕｒｆａｃｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ，ｗｈｉｃｈｗｅｒｅｔｈａｔｔｈｅｒａｔｉｏｏｆｗａｔｅｒｔｏｏｉｌｉｓ４，ｂｕｆｆｅｒｓｏｌｕｔｉｏｎｐＨ６．５，ｅｎｚｙｍｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ２０ｍｇ／ｇｏｉｌ，ｔｈｅｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｃｏｎｔｅｎｔｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｉｓ３５℃，ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｔｉｍｅ２４ｈ．Ｕｎｄｅｒｔｈｅｓｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｔｈｅｔｏｔａｌｏｆＤＨＡａｎｄＥＰＡｉｎｔｈｅｒｅａｃｔｉｖｅｐｒｏｄｕｃｔｗａｓ６１．４８％，ＤＨＡａｎｄＥＰＡｗａｓ５６．２２％ａｎｄｔｈｅｆｉｒｓｔ５．２６％ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＰｈｙｓｉｃａｌａｎｄｃｈｅｍｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｍｅａｓｕｒｅｄｕｐｔＯｓｔａｎｄａｒｄｏｆｆｉｓｈｏｉｌ．ＤＨＡａｎｄＥＰＡｇｌｙｃｅｒｉｄｅｓｗｅｒｅｓｅｐａｒａｔｅｄｂｙｓｉｌｉｃａｇｅｌｃｏｌｕｍｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈａｎｄｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＦｏｕｒｉｅｒｉｎｆｒａｒｅｄｓｐｅｃｔｒａ．Ｄｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｗｅｒｅｔｈｅｍａｉｎｃｏｍｐｏｎｅｎｔ，ｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｗｈｉｃｈｗａｓ６４．３２％．ＴｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｔｒｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌｓａｎｄｍｏｎｏａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌｓＴｈｒｏｕｇｈｓｔｕｄｙｗａｓ３５．２３％ａｎｄ０．４５％ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ｏｆｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ，ｔｈｅｏｎｒｅａｃｔｉｏｎｄｙｎａｍｉｃｓｒｅａｃｔｉｏｎｏｎｅｂａｓｉｃａｌｌｙａｃｃｏｒｄｅｄｗｉｔｈｔｈｅｒｅａｃｔｉｏｎｋｉｎｅｔｉｃｓｏｆｅｎｚｙｍａｔｉｃｒｅａｃｔｉｏｎｏｆｏｎｌｙＴｈｒｏｕｇｈｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｓｕｂｓｔｒａｔｅ．ｏｆａｎａｌｙｓｉｓｏｆｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｄａｔａ，ｔｈｅｋｉｎｅｔｉｃｐａｒａｍｅｔｅｒｓｌｉｐａｓｅ—ｃａｔａｌｙｚｅｄｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｏｆｍｏｌ／Ｓ．ｔｕｎａｏｉｌｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄ，Ｊｒ（ｍ＝Ｏ．４５ｍｏｌ／Ｌ，ｇｍ“＝０．１５Ｔｈｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｓｃａｎｎｉｎｇｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ（ＤＳＣ）ｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｍａｌｏｘｉｄａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓｏｆＤＨＡｏｆｇｌｙｃｅｒｉｄｅｓａｎｄＥＰＡｇｌｙｃｅｒｉｄｅｓＷａｓｃｌｏｓｅｌｙｒｅｌａｔｅｄｔｏｔｈｅｃｏｍｐｏｎｅｎｔａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｄｅｒｉｖａｔｉｖｅａｎｄｆａｔｔｙａｃｉｄｓ．Ｔｈｅｔｈｅｒｍｏｇｒａｖｉｍｅｔｒｙ（ＤＴＧ）ｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｔｈｅｒｍａｌｏｘｉｄａｔｉｏｎｏｆＤＨＡａｎｄＥＰＡｇｌｙｃｅｒｉｄｅｓｗ够ｈａｐｐｅｎｅｄｂｅｔｗｅｅｎ３００℃－５００℃．ＴｈｅｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｍｅａｓｕｒｅｓｓｈｏｕｌｄｂｅｔａｋｅｎｔｏａｖｏｉｄｔｈｅｔｈｅｒｍａｌｏｘｉｄａｔｉｖｅｅｍｅｒｇｅｎｃｅｏｆＤＨＡａｎｄＥＰＡｇｌｙｃｅｒｉｄｅｓ．ＴｈｅｋｉｎｅｔｉｃｐａｒａｍｅｔｅｒｓｗｅｒｅｃａｌｃｕｌａｔｅｄｕｓｉｎｇＦｌｙｎｎ－Ｗａｌｌ—ＯｚａｗａａｎｄＫｉｓｓｉｇｅｒｅｑｕａｔｉｏｎｓｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｗｈｏｓｅｒｅｓｕｌｔｓｗｅｒｅｃｏｈｅｒｅｎｔ．ＴｈｅｓｅｋｉｎｅｔｉｃｐａｒａｍｅｔｅｒｓｗｏｕｌｄｐｒｏｖｉｄｅｔｈｅｒｅｆｅｒｅｎｃｅｆｏｒｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇｔｈｅｓｈｅｌｆｌｉｆｅｏｆｔｈｅＤＨＡａｎｄＥＰＡｇｌｙｅｅｒｉｄｅｓ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＹｅｌｌｏｗｆｍＴｕｎａｏｉｌ，ＤＨＡａｎｄＥＰＡｇｌｙｃｅｒｉｄｅｓ，Ｌｉｐａｓｅ，Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｌｌ缩写ＤＧＤＨＡＤＳＣＤＴＧＥＰＡＦＴ－ＩＲＧＣＭＧＰＵＦＡＲＳＭＴＡＴＧ论文中的缩写名词及其含义全称ＤｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅＤＯＣＯＳａｈｅｘａｅｎｏｉｃＡｃｉｄＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌＳｃａｎｎｉｎｇＣａｌｏｒｉｍｅｔｒｙＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌＴｈｅｒｍｏｇｒａｖｉｍｅｔｒｙＥｉｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃＡｃｉｄＦｏｕｒｉｅｒＴｒａｎｓｆｏｒｍＩｎｆｒａｒｅｄＡｂｓｏｒｐｔｉｏｎＳｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙＧａｓＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙＭｏｎｏｇｌｙｃｅｒｉｄｅＰｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄＦａｔｔｙＡｃｉｄＳｕｒｆａｃｅＭｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙＡｎａｌｙｓｉｓ中文甘油二酯二十二碳六烯酸差示扫描量热法微商热重法二十碳五烯酸傅立叶变换红外光谱气相色谱甘油一酯多不饱和脂肪酸响应面法热分析ＲｅｓｐｏｎｓｅＴｈｅｒｍａｌＴｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ甘油三酯广东海洋大学学位论文独创性及知识产权声明本人郑重声明：所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得本校或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。本学位论文成果归广东海洋大学所有。指护撒枷臌加孙膨，霜研究生签名：列鹂辫．劫口６年５日喀Ｂｊ广东海洋大学硕士学位论文第一章绪论二Ｐ碳五烯酸（ＥＰＡ，ｅｉｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃａｃｉｄ）和二ｒ二碳六烯酸（ＤＨＡ，ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃａｃｉｄ）是水产生物中两种特有的ｎ＿３型多不饱和脂肪酸（ｎ－３ＰＵＦＡ，ｎ－３ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄｆａｔｔｙａｃｉｄ）。ＥＰＡ、ＤＨＡ的分子结构式如图１—１。ＥＭ｛Ｅｉ嘲ａｐ酬始咖ｌｃＡｃ呻Ｃ舱５＼，＝、，兰、／曙＝、一，＝鬻、／冒＼＾／Ｃｏ。Ｈ僻Ｗ咖｜ＩＩ霸哺ｆ雠恕两Ｃ翌：Ｓ＼／篁２＼，２气。，：。、，‘＝气。／＝＝、／盏絮、＾。｛）ｏＨ图１一ｌＤＨＡ和ＥＰＡ的结构式Ｆｉｇ１－１ＳｔｒｕｃｔｕｒｅｆｏｒｍｕｌａｏｆＤＨＡａｎｄＥＰＡ有关ＤＨＡ和ＥＰＡ的提取、富集、生理活’眭及临床应用，很多科研工作者都进行了大量的探索工作。目前对ＤＨＡ和ＥＰＡ的生理活性已经明确，它们不仅具有降血压、消除疲劳、预防动脉粥样硬化和脑血栓、抗癌等生理活性，而且能显著地促进婴儿的智力发育，改善大脑机能，提高记忆力，是生产预防心血管疾病和婴儿益智食品的良好基料。１．１ＤＨＡ和ＥＰＡ的生理功能和保健作用ＤＨＡ和ＥＰＡ对视力和大脑发育的促进作用【ｌ。１ＤＨＡ是视网膜的主要组成部分。约占４０－－５０％。Ｄ｝ｎ和ＥＰＡ能提供视觉神经所１．１．１需营养及机能成分，故可防止视力下降，多数中老年患者服用后视力明显改善，补充足够的ＤＨＡ对活化衰弱的视网膜细胞有帮助，对用眼过度引起的疲倦、老年性眼花、视力模糊、青光眼、白内障等疾病有治疗作用。ＤＨＡ是大脑细胞形成发育及运作不可缺少的物质基础。人的记忆力、思维功能都有赖于ＤＨＡ来维持和提高。大脑脂肪中大约１０％左右是由ＤＨＡ组成，缺少ＤＨＡ不仅感观功能衰退，还会影响记忆力与思维能力，ＤＨＡ摄入量增加可提高人们的阅读能力和记忆的效果。补充ＤＨＡ可促进脑细胞充分发育，防止智力下降、健忘、老年痴呆等。ＤＨＡ对提高儿童智力有好处。联合国粮农组织和世界卫生组织早在１９９５年推荐的膳食指南中明确规定【４］，婴儿配方奶粉中必须含有ＤＨＡ，美、Ｆ１等发达国家己立１脂肪酶水解鱼油富集ＤＨＡ、ＥＰＡ甘油酯的研究法规定必须将ＤＨＡ添加于各类婴幼儿食品中。据中华预防医学会负责人介绍，研究表明【５】，我国居民摄入的ｎ．３系列脂肪酸主要是ｍ亚麻酸，ＤＨＡ和ＥＰＡ的摄入量非常有限，很多内陆地区居民膳食中几乎检测不出ＤＨＡ和ＥＰＡ。因此，积极改善食物结构，增加含有ＤＨＡ、ＥＰＡ的海鱼产品的摄入量十分必要。当然，对于那些食用海产品困难，又十分需要增加ＤＨＡ、ＥＰＡ的人群，如早产儿，血甘油三酯高的成年人等，可以选择ＤＨＡ、ＥＰＡ补充荆。１．１．２ＤＨＡ和ＥＰＡ与心血管疾病根据国外最新的流行病学和临床实验提供的数据【６】，ＤＨＡ和ＥＰＡ等ｎ．３型多不饱和脂肪酸的摄取量和冠心病的发病率呈负相关，４０－－８０岁的男性病例摄取较多鱼肉可降低心脏猝死的危险。Ｆｒａｎｋ等１７１对１５１３例冠心病患者进行了１６年跟踪研究，比较摄取鱼类或ＤＨＡ和ＥＰＡ等１＂１．３型多不饱和脂肪酸较少的人群和较多的人群发生冠心病和非致命性的心肌梗死的危险性。结果发现每周摄取的鱼类越多，相对危险度越低。在英国对２０３３名恢复期心肌梗塞的患者研究发现，吃富含ＤＨＡ和ＥＰＡ等ｎ－３型多不饱和脂肪酸的海鱼组死亡率明显低于不吃海鱼组【８】。ｌ。１‘３ＤＨＡ和ＥＰＡ抑制血栓的形成大量的人体和动物实验表明【９—０１，ＤＨＡ和ＥＰＡ等ｎ一３型多不饱和脂肪酸在体内经过转化，可产生多种衍生物，具有抑制血小板凝集、增加血小板细胞膜流动性和改变细胞信号作用，从而抑制血栓的形成。１．１．４ＤＨＡ和ＥＰＡ降低甘油三酯和胆固醇动物实验和临床研究表明，ＤＨＡ和ＥＰＡ等ｎ．３型多不饱和脂肪酸可有效地降低血液中甘油三酯和胆固醇水平。ＤＨＡ和ＥＰＡ等ｎ．３型多不饱和脂肪酸不仅有效降低严重高甘油三酯血症患者的甘油三酯；而且可降低餐后高甘油三酯血症，并可以有效治疗混合型高脂血症【”】。１．１．５ＤＨＡ和ＥＰＡ影响血浆脂蛋白．胆固醇水平高密度脂蛋白（ｈｉｇｈｄｅｎｓｉｔｙｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ，ＨＤＬ）可逆向转运胆固醇，因而具有抗动脉粥样硬化的作用，而低密度脂蛋Ｉ！Ｉ（１０ｗｄｅｎｓｉｔｙｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ，ＬＤＬ）转运内源性胆固醇，被认为是动脉粥样硬化独立的危险因子。研究表明，ＤＨＡ和ＥＰＡ等ｎ－３型多不饱和脂肪酸具有降低ＬＤＬ．胆固醇和ＶＬＤＬ（极低密度脂蛋白）．胆固醇，增加ＨＤＬ胆固醇的作用【１２１。１．１．６ＤＨＡ和ＥＰＡ的降压作用降压实验表明，增加脂肪组织中的亚油酸不影响正常人的血压，而每增加１％的ａ．亚麻酸则使平均动脉压下降０．６７ｋＰａ。用含不同脂肪酸的饲料喂食自发性高血压的幼鼠发现富含ａ．亚麻酸的饲料可使幼鼠舒张压比其它幼鼠低２．８ＫＰａ【１３】。２４小时动态血压监测显示，每天摄入３．６５９ＤＨＡ和ＥＰＡ等ｎ－３型多不饱和脂肪酸１６周，可使收缩压下降０．９ＫＰａ，舒张压下降０．６８ＫＰａ。ＤＨＡ和ＥＰＡ等ｎ．３型多不饱和脂肪酸２广东海洋大学硕士学位论文的降压作用可能是降低内源性血管活性物质（如去甲肾上腺素）对血管的反应，也可能是前列腺素的直接作用。１．１．７ＤＨＡ和ＥＰＡ与动脉粥样硬化多数实验研究显示，ＤＨＡ和ＥＰＡ等ｎ．３型多不饱和脂肪酸可以延缓动脉粥样硬化的进程。日本一项流行病学研究结果表明，农村居民动脉粥样斑块数是渔村居民的５～８倍，且ＤＨＡ和ＥＰＡ等ｎ．３型多不饱和脂肪酸与颈动脉斑块数呈负相判１４１，ｎ－６型多不饱和脂肪酸斑块数呈弱的正相关。一项尸检研究显示，爱斯基摩人血管内膜脂质条纹和呈现的损害更少，且在低龄时期脂质条纹与内陆居民的区别更大【１５］。脂肪组织中的脂肪酸组成，可以客观的反映从食物中摄取的脂肪类型。Ａｎｇｅｒｅｒ等研究发现冠状动脉病变的程度和脂肪组织中ＤＨＡ浓度和体重呈负相关。２２３例经冠状照影证实为冠心病的患者，每天摄入１．６５９的ＤＨＡ和ＥＰＡ等ｎ．３型多不饱和脂肪酸，２年后结果表明ｎ＿３型多不饱和脂肪酸的摄入减缓了冠状动脉粥样硬化的进程‘Ｍ１。１．２脂肪酶法富集ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯的研究进展ＤＨＡ和ＥＰＡ等ｎ－３ＰＵＦＡ在人体生物学中的重要功能己得到世人的共识。目前，国际市场上的鱼油保健品，ＤＨＡ和ＥＰＡ的存在形式有三种：游离型，甲、乙酯型和甘油酯型。在天然鱼油中，ＤＨＡ和ＥＰＡ是以甘油酯的形式存在，其相对含量比较低，保健和医疗效果比较差，难以满足消费者的需要。为了提高ＤＨＡ和ＥＰＡ的保健和医疗效果，众多研究者将甘油酯中的ＤＨＡ和ＥＰＡ转酯化或者水解转化为相应的乙酯或者游离形式，然后再通过各种物理或者化学方法提高ＤＨＡ和ＥＰＡ的含量，以此来增强ＤＨＡ和ＥＰＡ的保健和医疗效果。１９９０年美国ＦＤＡ的研究人员通过大量实验后，发现ＤＨＡ和ＥＰＡ的甘油酯型、乙酯型和游离脂肪酸型在人体内消化吸收有差异。Ｉｋｕｏ［１７－１９１等研究的结果也表明，ＤＨＡ和ＥＰＡ乙酯型在人体中不仅消化和吸收比较困难，而且可能存在安全隐患；游离型的ＤＨＡ和ＥＰＡ虽然易于被人体消化和吸收，但是容易氧化生成对人体有害的物质，而且有酸味、口感不好，直接作为食用难以被人们接受；ＤＨＡ和ＥＰＡ的甘油酯型不仅性质稳定、不易氧化、口感好、易被人体消化吸收，而且是ＤＨＡ和ＥＰＡ的天然存在形式，因此ＤＨＡ和ＥＰＡ的甘油酯型是保健品和药品的最佳产品型式。再者，随着人们生活水平的提高，消费者对天然鱼油甘油酯型保健品中ＤＨＡ和ＥＰＡ含量低不再满足，期望提供安全性好，ＤＨＡ和ＥＰＡ含量高的甘油酯型保健品。海产鱼类中ＤＨＡ和ＥＰＡ的总含量在３％一３０％之间。大型洄游性鱼类如金枪鱼、鲣鱼等的ＤＨＡ和ＥＰＡ含量在３０％左右，而一些中上层低值鱼类如鲐鱼、蓝圆黪等的ＤＨＡ和ＥＰＡ含量在３％也Ｏ％。从海产鱼类中提取的天然鱼油，ＤＨＡ和ＥＰＡ基本都以甘油酯的形成存在，其含量相对较低，如不进行浓缩富集，其医疗和保健效果并不理想。目前，如何提高天然鱼油中ＤＨＡ和ＥＰＡ的含量是一个亟待解决的技术问题。脂肪酶水解鱼油富集ＤＨＡ、ＥＰＡ甘油酯的研究因此，为了增强鱼油产品的竞争力和满足人们的物质文化生活需要，加强保健鱼油的技术丌发力度，扩大保健鱼油的生产就显得十分必要。ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯是未来鱼油保健品及药品的主要发展方向。ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯主要从海洋生物（如金枪鱼、沙丁鱼、鳕鱼等鱼油）中提取获得，但是鱼油中ＤＨＡ、ＥＰＡ含量较低，采用化学或物理方法很难将其中的ＤＨＡ、ＥＰＡ含量大大提高。近年来，利用微生物酶富集ＤＨＡ和ＥＰＡ的方法逐渐受到人们的重视。与物理和化学方法相比，酶法有一系列的优点，首先，酶催化效率高，在大规模的生产中用量很少，且固定化酶能多次的重复利用；再则，酶催化反应在温和的ｐＨ、温度和压力下进行，这对不稳定的长链ＤＨＡ和ＥＰＡ来说尤为重要。在通常的理化反应条件下长链ＤＨＡ和ＥＰＡ中顺式结构双键被氧化、顺反异构、双键的移位和聚合反应都易发生；最后，酶催化反应能降低能量的消耗，这在能源短缺的时代是非常必要的。进一步说，出于酶催化反应能在无溶剂条件下进行，可以避免庞大的设备和繁杂的工艺流程，而操作人员也能在安全的条件下工作。因此，利用酶工程技术将ＤＨＡ和ＥＰＡ富集在甘油酯上是～种非常有效的方法。脂肪酶法富集ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯又分为脂肪酶选择性水解、脂肪酶选择性酯交换和脂肪酶选择性酯化等【２０】。１．２．１脂肪酶选择性水解法通常认为鱼油的甘油三酯中２位上连接着ＤＨＡ和ＥＰＡ等ｎ．３ＰＵＦＡ，ｌ、３位上连接着饱和的和低度不饱和脂肪酸，这样其分子由上而下的三个酯键（１、２、３）有空间差异。有的脂肪酶具有１、３位置选择性，利用酶的位置选择性水解掉ｌ、３位上的饱和的或单不饱和的脂肪酸，从而使ｎ．３ＰＵＦＡ富集在甘油酯的２位上。有的脂肪酶虽然对甘油酯无位置选择性，但对酰基碳链有选择性，就可水解掉任何位置的非ｎ－３ＰＵＦＡ脂肪酸，得到富含ｎ－３ＰＵＦＡ的甘油一酯、甘油二酯和甘油三酯的混合物。Ｂｏｔｔｉｎｏ等１２ｌＪ人认为脂肪酶对酰基碳链的选择性与鱼油中ｎ－３ＰＵＦＡ对脂肪酶水解的抵抗作用有关。不饱和脂肪酸分子中存在碳碳双键和全顺式构型，引起整个链的弯曲，因此在甘油酯分子上不饱和脂肪酰中靠近酯键的最末端甲基对脂肪酶的进攻形成空间阻碍。ＤＨＡ和ＥＰＡ分子中分别有六个和五个双键，导致全顺式构型的整个链高度弯曲，加强了这种空间阻碍作用，使得脂肪酶难以接触到ＤＨＡ和ＥＰＡ与甘油形成的酯键，故脂肪酶对甘油酯上的ＤＨＡ和ＥＰＡ酰基作用较弱。但饱和的和单不饱和的脂肪酰在空间上对酶分子不存在这样的空问阻碍，因而很容易被水解掉。机理见图ｌ－２。．．．．．．．一０Ｈ厂［ｌ薹一屿２Ｅ伽ＰＵＦＡ＋ＲＩＣＯＯＨ＋Ｒ：ＣＯＯＨ图ｌ－２脂肪酶选择性水解的机理Ｆｉｇ１－２Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｌｉｐａｓｅ－ｃａｔａｌｙｚｅｄｓｅｌｅｃｔｉｖｅｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ４广东海洋大学硕士学位论文利用脂肪酶水解法富集ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯，国外已在２０世纪９０年代开展了大量的研究工作，我国是在２０００年后才‘有资料报道这方面的研究。但是到目前为止，还没有高含量的ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯产品上市。通过脂肪酶的选择性水解来富集ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯，关键是要筛选出具有良好选择性的脂肪酶和控制好水解过程参数，以防止甘油酯的完全水解。Ｗａｎａｔｍｄａｒａ等Ｉ丑Ｊ人对多种商业化的脂肪酶进行筛选，发现柱形假丝酵母脂肪酶（Ｃａｎｄｉｄａｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａｌｉｐａｓｅ）水解富集ＤＨＡ和ＥＰＡ的效果最好，可使海豹油中ＤＨＡ和ＥＰＡ含量提高至４３．５％，使鲱鱼油中ＤＨＡ和ＥＰＡ含量提高至４４．１％。Ｔａｎｋａｌ２３＋２４］等人在筛选六种脂肪酶的选择性水解金枪鱼油的能力中发现也是柱形假丝酵母脂肪酶水解富集ＤＨＡ和ＥＰＡ的效果最好，甘油酯中ＤＨＡ含量增加了３倍，而其它五种酶，并没有使ＤＨＡ含量明显增加。Ｓｈｉｍａｄａ等［２５－２７１用四种脂肪酶选择性水解富集ＥＰＡ，发现通过高度水解来富集鱼油中的ＥＰＡ是困难的。Ｈｌｌｒｌ２８１等人在研究中阐述了脂肪酶对ｓｎ一１、３位的特殊选择性的重要性。为了增加选择性水解富集ＤＨＡ和ＥＰＡ的效率，研究者采用了各种办法，Ｓｈｉｍａｄａｔ２９３０］等采用逐步酶水解法，第一步水解后，用物理的方法除去游离脂肪酸，剩余的甘油酯进一步用脂肪酶在同样的条件下再水解，甘油酯中ＤＨＡ和ＥＰＡ含量可增加至５７．５％，得率为１６．３％。Ｓｕｎ等川人以从鲑鱼内脏中提取的鱼油为原料，用６种脂肪酶催化水解富集ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯，结果发现来自洋葱假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｃｅｐａｃｉａ）和假丝酵母（Ｃａｎｄｉｄａｒｕｇｏｓａ）脂肪酶的富集效果比较好，可使原料鱼油中ＤＨＡ和ＥＰＡ含量增加两倍。Ｏｋａｄａ等１３２１人用假丝酵母（Ｃａｎｄｉｄａｒｕｇｏｓａ）脂肪酶选择性水解沙丁鱼油６ｈ，ＥＰＡ和ＤＨＡ在甘油酯中含量分别由２６．８６％和１３．６２％增加至３４，４５％和２８．０２％。Ｋｏ等【３３】人利用表面活性包裹的假丝酵母（Ｃａｎｄｉｄａｒｕｇｏｓａ）脂肪酶在水油两相中对金枪鱼油进行选择性水解，结果甘油酯中的ｎ－３ＰＵＦＡ含量由原来的２６．４％增加到４９。８％，ＤＨＡ含量由原来的１９．１％增加到３８．９０／ｏ。在我国，石红旗等１３４Ｊ人研究了以国产解脂假丝酵母（Ｃａｎｄｉｄａｒｕｇｏｓａ）脂肪酶在适宜的条件下水解鱼油，制备了的富含ＤＨＡ和ＥＰＡ的甘油酯产品，ＤＨＡ和ＥＰＡ含量分别为３４．０％和１３．９％，总含量为４７．９％，ＤＨＡ甘油酯产品经高效液相色谱分离、红夕｝光谱分析确证为甘油酯混合物，包括单甘油一酯（ＭＧ），甘油二酯（ＤＧ）和甘油三酯（ＴＧ）３种形态。吴可克等【３５Ｊ人以鳕鱼油为原料，研究了国产假丝酵母（Ｃａｎｄｉｄａｒｕｇｏｓａ）脂肪酶的选择性水解条件，结果表明在适宜条件下鱼油中的ＤＨＡ和ＥＰＡ含量由原来的７．９７５％和１２．０１６％增加至２９．３７％和２３．２６％。吴可克等【３６】人还以深海鱼油为原料，脂肪酶为催化剂，尝试了搅拌式反应器、渗透膜反应器、中空纤维式反应器对鱼油的选择性水解反应的影响，结果表明带有固定化酶的搅拌式反应器对酶促鱼油部分水解反应为最适反应器。王运吉等【３７】人以聚氨酯泡沫为载体，采用固态培养的方法固定化ＲｈｉｚｏｐｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓＷＺＨ－８细胞，研究了固态培养条件和固定化胞内脂肪酶的性质及其在选择性水解鱼油富集ｎ－３多不饱和脂肪酸（ｎ－３ＰＵＦＡ）＠的应用，结果表明：脂肪酶水解鱼油富集ＤＨＡ、ＥＰＡ甘油酯的研究在最佳条件下，固定胞内脂肪酶与非固定化的自由菌丝胞内脂肪酶相比，前者水解活力提高了２５％以上；ｐＨ和热稳定性也显著提高；半衰期为８３６ｈ；酶法选择性水解鱼油，ｎ一３ＰＵＦＡ由２７％提高到５３％９上。郑毅等‘３列人通过对５种不同来源脂肪酶的筛选，以来源于米曲霉脂肪酶为最佳酶种，在该酶的最佳水解鱼油的条件下，鱼油中ＥＰＡ和ＤＨＡ分别由３．０％和４．３％提高到９．Ｏ％和１６．５％。１．２．２脂肪酶选择性酯交换法脂肪酶选择性酯交换法是通过选择不同活力的脂肪酶，使鱼油中的甘油酯与游离的ｒｔ－３ＰＵＦＡ、醇或另～酯发生的酰基交换反应，结果使鱼油中的ｎ－３ＰＵＦＡ较多的分布在甘油酯中，达到富集的目的［３９，４０］。酯交换可分为三个过程：酸解、醇解、酯酯交换，反应的机理见图１．３。广一ｏＣｏＲｌｒ—ＰＵＦＡ＋ｎ－３卜一ＰＵＦＡＬ—ＯＣＯＲ２ＰＵＦＡ·Ｉ＊’｝－——一ＰＵＦＡ＋Ｒ１ＣＯＯＨ十ＲｊＣＯＯＨＬ—ＰＵＦＡ广ｏＣｏＲｌ广一ＯＨｔ－ＰＵＦＡＬ—ｏＨＬｏＣｏＲ２厂ｏＣｏＲｌ广一ＰＵＦＡ卜＿ＰＵＦＡ十Ｒ，ＣＯＯＲ’；二二！卜一ＰＵＦＡ＋ＲＩＣＯＯＲ’，＋Ｒ２ＣＯＯＲ＇’ＬＬ—ＯＣＯＲ２＋ＲＯＨ；＝２卜＿ＰＵＦＡ＋ＲｌＣＯＯＲ＋Ｒ２ＣＯＯＲＰＵＦＡ图１－３日目肪酶选择性醑交换机理（Ｒ’为ＰＵＦＡ）Ｆｉｇ１－３Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｌｉｐａｓｅ－ｃａｔａｌｙｚｅｄｓｅｌｅｃｔｉｖｅｅｓｔｅｒｅｘｃｈａｎｇｅ酸解富集是利用脂肪酶的选择性将连接在１、３位的饱和脂肪酰基和单不饱和脂肪酰基与高浓度的ｎ－３ＰＵＦＡ发生酰基交换作用，从而将ｎ．３ＰＵＦＡ富集在甘油酯上。Ｔａｋａｓｈｉ等【４ｌｌ在底物比６：１（ｎ－３ＰＵＦＡ：鱼油）、固定化脂肪酶３０ｗｔ％、水分含量５ｗｔ％的条件下，经酸解富集甘油酯中小３ＰＵＦＡ含量增至６２％。‰ｎ粕ｅ【４２１等在利用ＤＨＡ酸解反应中发现鱼油中ＥＰＡ含量在前５ｈ是下降的，而ＤＨＡ含量在正常酸解反应中是增加的，可能是由于鱼油中ＥＰＡ被ＤＨＡ所取代而达到一个新的平衡。为增加反应的效率，Ｙａｍａｎｅ等［４ａｌ采用两步酸解法，首先在超临界Ｃ０２中进行３ｈ，然后在真空下进行５－２４ｈ，这样可使甘油二酯的含量减少；通过一套由水套式填充柱和底物混合器（温度保持在．１０’Ｃ或．２００Ｃ）中间由管道连接组成的循环装置可从反应混合物中除去结晶的饱和和单不饱和的脂肪酸，从而提高ｎ．３ＰＵＦＡ的含量。Ｎｏｚｏｍｉ等ｍ】还研究了将酶水解和酸解联合应用富集ｎ－３ＰＵＦＡ中，认为将ｎ－３ＰＵＦＡ可以富集到一些有价值的植物油中，生产出具有更高利用价值的构造脂质。在酸解反应中，水分含量和酶活性是影响反应效率的两个重要参数。如果底物中水分含量太高，酸解会向水解的副反应方向进行：另一方面如果水分太低，它又会影响酶活性。这种双重效应使得酸解６广东海洋大学硕士学位论文反应将ｎ．３ＰＵＦＡ富集在甘油酯中的效率比较低，这是酸解反应的一个最大缺点。虽然酸解富集可以将甘油酯中ｎ．３ＰＵＦＡ的含量提高到５０％左右，但是需要较高浓度的ｎ－３ＰＵＦＡ为前提。因此醇解富集为提高甘油酯中ｎ一３ＰＵＦＡ的含量提供了另外一个技术途径。醇解富集ｎ．３ＰＵＦＡ的机理和水解一样，利用脂肪酶的１、３位置选择性，使连接在１、３位的饱和脂肪酰基和单不饱和脂肪酰基与一些短链的脂肪醇发生酯化作用，从而将ｎ．３ＰＵＦＡ富集在甘油酯上。Ｈａｒａｌｄｓｓｏｎ等【４５】在１０％脂肪酶、一定量的乙醇、２０℃和反应２４ｈ的条件下，甘油酯中ｎ．３ＰＵＦＡ的含量增至５０％左右，ＥＰＡ和ＤＨＡ的回收率分别是９０％：ｆＦｌ８０％。Ｗａｔａｎａｂｅ等【４６】认为脂肪酶在…定量的乙醇中可能会失活，为了避免这种情况发生，采用逐步加入乙醇的方法，第一步醇解在４０℃、１／３量的乙醇、４％固定化脂肪酶的条件下反应ｌＯｈ，乙醇被消耗，３３％的金枪鱼油被转化为相应的酯；第二步，加入剩余的乙醇，反应３６ｈ，经过逐步醇解９５％的金枪鱼油被转化为相应的酯。在醇解反应中，水分含量和脂肪醇的类型是影响醇解效率的两个关键因素。Ｌｉ等【４７】人对十种醇进行醇解筛选，发现异丙醇和乙醇用于醇解最合适，也有研究者认为月桂醇最合适。酯酯交换反应是利用脂肪酶选择性催化甘油酯中１、３位的酰基与ｎ一３ＰＵＦＡ的乙酯发生酰基交换反应，得到ｎ一３ＰＵＦＡ含量更高的甘油三酯。目前关于这方面的报道还很少。１．２３脂肪酶选择性酯化法乩●ｎ－３ＰＵＦＡ和ｌｉｐａｓｅ，Ｈ－－［ＯＣＨＯＲｌ●２２２＝２＝２２２２＝’卜—－ＵＨＬ—ＯＣＯＲ２ｌ－甘油一酯１、３·Ｈ油二酯Ｕ油醚位怯ＯＲ，罢篓肇ＯＣＯＲｏｃ１：‘……‘……’ＬＬ２～酯峭…，；二详墙广＿一ｏｃ０Ｒ２ＬＯＣＯＲｌＩ．一ＯＣＯＲ３图１—４ｎ．３ＰＵＦＡ和甘油的脂肪酶催化酯化机理Ｆｉｇ１－４Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｌｉｐａｓｅ－ｃａｔａｌｙｚｅｄｅｓｔｅｒｉｆｉｅａｔｉｏｎｏｆｎ－３ＰＵＦＡａｎｄｇｌｙｃｅｒｏｌ脂肪酶选择性水解法和脂肪酶选择性酯交换法由于受天然鱼油中ｎ一３ＰＵＦＡ含量脂肪酶水解鱼油富集ＤＨＡ、ＥＰＡ甘油酯的研究低的限制，使得ｎ．３ＰＵＦＡ在甘油酯中的含量仍然得不到较大提高，因此脂肪选择性酯化就成为提高ｎ．３ＰＵＦＡ在甘油酯中含量的一个新的重要技术途径。脂肪酶选择性酯化是指脂肪酶选择性的催化游离脂肪酸中ｎ－３ＰＵＦＡ与甘油反应生成甘油酯，而ｎ一３ＰＵＦＡ富集在甘油酯分子上，从而达到富集的目的。这种方法一般先使鱼油完全水解，浓缩富集制得高纯度的ｎ．３ＰＵＦＡ，再在脂肪酶的催化下与甘油发生酯化反应【４ｓＪ。利用此法可得到ｎ－３ＰＵＦＡ含量达７０％以上的甘油酯。酯化反应机理见图１．４。Ｙｈ等１４９－５ｑ研究在酶催化酯化反应中强调使用有机溶剂的重要性，选择合适的有机溶剂体系可为底物提供均一的系统，改变酶分予对底物的选择性和亲和力，产生各种各样的物理化学效应。“等”２Ｊ对甘油和ｎ一３ＰＵＦＡ在有机溶剂体系中的酯化反应进行了深入研究，脂肪酶ＩＭ．６０的酯化度达到了９２．４％，由于该酶具有ｌ、３位置选择性，产物主要以甘油二酯为主，而甘油三酯含量较少。Ｃｅｒｄａｎ等［５３，５４］在对脂肪酶Ｐｓ、ＩＭ和４３５进行催化合成研究中发现，脂肪酶４３５的酯化度达到了９５％以上，该酶具有宽广的专一性，产物中甘油三酯的含量达到９３．５％，ＧＣ分析ｎ－３ＰＵＦＡ的含量达到７０％以上。Ｈｅ等［ｓ５１对多种脂肪酶进行酯化反应筛选，发现来源于染色粘性菌（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｌ／ｌｓｃｏｓｕｒｌｌ）的脂肪酶酯化富集的效果最好，在异辛烷体系和最佳工艺５％水（ｇ／甘油）、底物比ｌＯ：１（ｇ／ｇ）、酶４０ｍｇ、５０℃反应４８ｈ条件下酯化率为９４．３％。Ｈａｒａｄｓｓｏｎ等１５６】在无溶剂系统中进行酯化反应富集，添加１０％的ＣａｎｄｉｄａＡｎｔａｒｃｔｉｃａｎｏｎ．ｒｅｇｉｏｓｐｅｃｉｆｉｃ脂肪酶，在真空、６５℃下反应２４ｈ，ｎ－３ＰＵＦＡ的酯化率为９７％，若反应时间延长为７２ｈ，酯化率可达１００％。Ｒｏｓｕ等Ｉ”Ｊ认为Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ脂肪酶对ＤＨＡ有较好的选择性，将该酶固定在碳酸钙粉上，在真空条件下反应５ｈ，ＤＨＡ的酯化率为９０％。体系中水分含量影响着反应的平衡和酶的活性，因为水是反应的产物，大量水的生成又会导致已富集了ｎ．３ＰＵＦＡ的甘油酯重新发生水解，分子筛的加入可以有效除去多余水分提高酯化率。影响酯化反应的因素较多，为更好的控制反应过程参数，Ｌｉｎｄｅｒ等［ＳＳｌ利用响应面优化方法对酶法合成的过程参数进行了优化，在最佳的因素水平组合下，酯化度达到了９７％。以上的研究都表明酶促合成法很容易将１１．３ＰＵＦＡ富集到甘油酯中，酯化度可达９０％以上，甘油酯中ｎ－３ＰＵＦＡ的总含量可达７０％以上。１．２。４小结脂肪酶选择性酯交换和脂肪酶选择性酯化，这两种方法反应的前提是需要高浓度的ＤＨＡ、ＥＰＡ做底物，而高浓度的ＤＨＡ、ＥＰＡ需要通过其它物理或者化学方法富集得到，生产工序繁多，操作复杂，生产成本较高，而且容易有有机溶剂残留。脂肪酶选择性水解法可以克服以上两种方法的缺点，其操作简单，投入设备少，只需要脂肪酶的一步水解就可以使甘油酯中的ＤＨＡ和ＥＰＡ达５０％以上，能够满足保健鱼油的要求，而且生产成本较低。因此脂肪酶选择性水解富集ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯是一种既实用又有效的方法。广东海洋大学硕士学位论文１．２．５展望ＤＨＡ和ＥＰＡ主要以甘油酯的形式存在于深海鱼类的脂肪组织中，一般ＤＨＡ和ＥＰＡ总含量为３％一３０％。在过去，由于天然型的甘油酯所含ＤＨＡ和ＥＰＡ的浓度较低；而脂肪酸乙酯型易得到高纯度的产品，研究者们多偏重于对ＤＨＡ和ＥＰＡ乙酯型的研究，而对其甘油酯型产品研究相对较少。但是近年来，对鱼油保健品，人们对其剂型为脂肪酸型、甲乙酯型的安全性提出了质疑，对天然鱼油甘油酯型保健品中ＤＨＡ和ＥＰＡ含量低不再满足，期望提供安全性好、ＤＨＡ和ＥＰＡ含量高的甘油酯型保健品。另外，ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯在消化道中的水解速率比物理或化学方法富集得到的相应的甲酯或乙酯快，同时，ＤＨＡ和ＥＰＡ的甘油酯比其甲酯或乙酯更适合机体吸收。从市场角度考虑，ＤＨＡ和ＥＰＡ的单酰、双酰和三酰甘油酯将因为比相应的游离脂肪酸和烷基酯更“天然”而畅销。因此，ＤＨＡ和ＥＰＡ的甘油酯产品将是未来鱼油保健品的主要发展趋势，我们应充分利用资源和技术上的优势，大力开发ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯型产品。脂肪酶选择性水解富集ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯，目前在国内外已有资料报道，但是还没有产品上市。因此，我们必须加强对这项技术的开发力度，争取有自主知识产权的专利技术，为开发高含量ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯型鱼油保健品提供理论基础。另外，近年来随着捕捞强度增大，海洋渔业资源逐年衰减，海洋捕捞的中低值鱼产量呈上升趋势，占海洋捕捞产量的５７％～５９％，大部分用于生产饲料，产品的附加值低，企业经济效益低下，还有一部分资源被抛弃掉，这不仅浪费资源，而且污染环境。因此，该项目的关键技术也可为低值鱼资源的高效利用提供很好的技术途径，这对于高效利用海洋生物资源生产高附加值产品和促进海洋经济发展都具有积极和重要的现实意义。１．３研究内容和方法本研究在前人研究的基础上，以黄鳍金枪鱼鱼油为原料，采用脂肪酶选择性水解法富集ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯，并对其反应机理，产物的理化性质和组成以及氧化动力学等进行一系列的研究。该项研究将不仅丰富水产品综合利用和油脂酶法改性的理论，而且也将为开发新一代的鱼油保健品提供技术途径。具体内容与方法如下：（１）脂肪酶选择性水解鱼油的工艺参数研究：在该项研究中先采用单因素试验考察影响ＤＨＡ、ＥＰＡ在甘油酯中含量的各个因素，确定其影响显著性和变化范围，然后再用响应面试验设计优化其工艺参数。（２）ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯的理化性质和组成分析：在该项研究中首先对ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯的理化性质（主要是过氧化值、酸值、碘值和皂化值）进行分析，并与天然鱼油的理化性质进行分析比较；然后采用气相色谱法分析其脂肪酸组成，同样与天然鱼油进行比较；为了分析ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯的组成，采用硅胶柱层析技术进行９脂肪酶水解鱼油富集ＤＨＡ、ＥＰＡ甘油酯的研究分离，分离物进行红外扫描鉴定其甘油酯的类型。（３）对脂肪酶酶促鱼油水解的动力学进行研究：脂肪酶催化鱼油水解属于单底物的酶促反应，因此，根据单底物酶促反应动力学理论研究脂肪酶催化鱼油水解的反应机理和动力学模型，并由试验数据得出了动力学参数。在理论上阐明酶促反应的机制，了解反应的具体过程和途径，为控制反应进行的程度和估算水解反应进行到某种程度所需的时间等实际应用奠定了理论基础。（４）ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯的热稳定性和氧化动力学研究：采用差示扫描量热（ＤＳＣ）技术对ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯在空气气氛下的热氧化反应，求出了热氧化反应的动力学参数，为甘油酯的加工、贮藏、和消费过程提供基础性数据。ｊ０广东海洋大学硕士学位论文第二章脂肪酶水解鱼油富集ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯的工艺研究鱼油是天然甘油酯，通常认为鱼油甘油三酯中２位上连接着ＤＨＡ和ＥＰＡ等高度不饱和脂肪酸，１、３位上连接着饱和的和低度不饱和脂肪酸，这样其分子由上而下的三个酯键（１、２、３）有空间差异，大多数脂肪酶作用在ｌ、３位上。利用酶的位置选择性水解掉１、３位上的饱和的或单不饱和的脂肪酸，从而使ＤＨＡ和ＥＰＡ富集在甘油酯的２位上。有一些脂肪酶虽然对甘油三酯无位置选择性，但对酰基碳链有选择性，这样的选择性可水解掉任何位置的非ＤＨＡ和ＥＰＡ脂肪酸，得到富含ＤＨＡ和ＥＰＡ的甘油三酯、甘油二酯和少量甘油一酯，且ＤＨＡ和ＥＰＡ的回收率较高。Ｂｏｔｔｉｎｏ等ｐ州人的研究认为脂肪酶的这种选择性与鱼油中的长链ｎ．３不饱和脂肪酸对脂肪酶水解作用的抵抗作用有关。由于不饱和脂肪酸分子中存在碳碳双键和全顺式构型，引起整个链的弯曲。因此在甘油酯分子上不饱和脂肪酸中靠近酯键的最末端甲基对脂肪酶的进攻形成空间阻碍。ＤＨＡ和ＥＰＡ分子中分别有六个和五个双键，导致全顺式构型的整个碳链高度弯曲，加强了这种空间阻碍作用，使得脂肪酶难以接触到ＤＨＡ和ＥＰＡ与甘油形成的酯键，故脂肪酶对甘油酯上的ＤＨＡ和ＥＰＡ酰基作用较弱。但饱和的和单不饱和的脂肪酸在空间上对酶分子不存在这样的空间阻碍，因而酶很容易水解。本章以黄鳍金枪鱼鱼油为原料，对影响脂肪酶催化水解甘油酯的因素（如脂肪酶的种类、油水比、有机溶剂的种类、反应的温度、激活剂的种类、缓冲液ｐＨ、脂肪酶浓度和反应时间等）分别选取５个以上的水平，以产物中ＤＨＡ、ＥＰＡ的总含量为指标，进行单因素试验，初步确定各个影响因素的显著程度和变化范围。对影响比较显著的因素选择合适的水平，采用响应面（ＲＳＭ）试验设计对工艺参数进行优化，通过试验统计学的处理，得到合理的数学模型，确定反应的最佳因素水平组合。２．１材料与方法２．１．１材料黄鳍金枪鱼鱼油：利用蛋白酶酶解法从黄鳍金枪鱼鱼头中提取，然后采用脱胶、脱酸、脱色和脱臭等工艺对其进行精炼，除去杂质成分即得精制黄鳍金枪鱼鱼油。脂肪酶ＯＦ：是由ＣａｎｄｉｄａＣｙｌｉｎｄｒａｃｅａ（Ｃ．ｒｕｇｏｓａ）得到的脂肪酶，是一种没有位置专一性的酶，能把三酰基甘油酯水解成脂肪酸和甘油，有很高的活力。其外观为白色粉末，酶活力为３６０，ｏｏｏｕ／ｇ粉末，分子量为６０，０００（ＳＤＳ．ＰＡＧＥ），最适ｐＨ为６－７，在ｐＨ为３．８该酶稳定，在温度为４０．５０＂Ｃ的范围内有最高的活力，在低于３７℃的水溶液中稳定，在低于２５。Ｃ的条件下储藏。酶由日本ＭｅｉｔｏＳａａｇｙｏＣｏ．，Ｌｔｄ．Ｎａｇｏｙａ赠送。脂肪酶Ｎｏｖｏ４３５：是由Ｃａｎｄｉｄａａｎｔａｒｃｔｉｃ得到的脂肪酶，用一种经过基因改良的脂肪酶水解鱼油富集ＤＨＡ、ＥＰＡ甘油酯的研究米曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚｅｅ）微生物进行深层发酵并吸收在～种大孔型树脂上而制成，出直径范围为０．３ｍｍ，－－Ｏ．９ｍｍ的小球状颗粒组成，产品含水量为ｌ％～２％，其活力１００００Ｕ／ｇ。该酶具有宽广的底物专一性，耐热性很高，在７０℃～８０℃范围内有最高的活力，由于提高温度下的反应会引起酶的受热失活，为保持优化的生产率，推荐在４０６Ｃ～６０℃范围内操作。可以在不用溶剂的体系中使用，也可以在石油醚和正己烷等惰性溶剂中使用，效果都是良好的。保存在０＊Ｃ～２５℃的密闭容器中，保持干燥，避免阳光直晒。购自丹麦诺维信公司。ＬｉｐｏｚｙｍｅＴＬＩＭ：是一种由微生物制备的１、３位专一性的食品级脂肪酶固定在颗粒硅胶上的制剂。从Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ得到的。用一种基因改性米曲霉微生物经过深层发酵生产的。催化活力２５０Ｕ／ｇ，表观密度Ｏ．５４９／ｍＬ，颗粒直径０．３ｍｍ～１．Ｏｍｍ，水分含量５％（重量比）。在５５℃ｏＯ℃范围内活力最大。该酶是一种能在机械力作用下保持稳定的颗粒，既可以使用在分批操作中，也可以在固定床连续操作中使用，但是它只能在非水介质中使用，因为在水中这种颗粒会崩解。保存在Ｏ＇Ｃ～２５℃的密闭容器中，保持干燥，避免阳光直晒。购自丹麦诺维信公司。ＬｉｐｏｚｙｍｅＴＬ１００Ｌ：是一种液体脂肪酶，具有１、３位专一性的食品级脂肪酶，主要用于油脂的水解。购自丹麦诺维信公司。２．１．２试剂与仪器试剂名称生产厂家纯度级别氢氧化钾广州化学试剂公司分析纯９５％乙醇广州化学试剂公司分析纯丙酮广州化学试剂公司分析纯正己烷广州化学试剂公司分析纯氢氧化钾广东台山化工厂分析纯乙醚广州化学试剂公司分析纯氯仿广州化学试剂公司分析纯甲醇广州化学试剂公司分析纯氯化钙广东台山化工厂分析纯磷酸二氢钾广东台山化工厂分析纯磷酸氢二钾广东台山化工厂分析纯柠檬酸广东台山化工厂分析纯碳酸钠广东台山化工厂分析纯氯化镁广东台山化工厂分析纯氯化钾广东台山化工厂分析纯１２广东海洋大学硕士学位论文仪器名称型号ＴＨＺ一８２型电热恒温震荡水浴槽ＦＡ２１０４Ｓ型电子天平Ｎ１０００真空旋转蒸发仪ＧＣ．１４Ｂ气相色谱仪ＣＲ．６Ａ数字记录仪２．１．３试验方法生产厂家上海浦东跃欣科学仪器厂上海天平仪器厂上海托普仪器有限公司日本岛滓日本岛津２．１．３．１脂肪酶水解鱼油的工艺过程称取鱼油２．００９于５０ｍＬ锥形瓶中，加适量的酶，加入适量的水。充氮密封，放入恒温水浴锅以１５０ｒ／ｍｉｎ的速度震荡反应，反应完毕后加１０ｍＬ乙醇和１０ｍＬ丙酮摇匀，使油样充分溶解后，加入２滴酚酞指示剂，用Ｏ．５ｍｏｌ／ＬＫＯＨ溶液滴定至微红色。加２５ｍＬ正己烷萃取，震荡后转移到分液漏斗，分层得到上层油层，用水洗涤除去脂肪酸赴，至上层澄清透明，转移到烧瓶旋转蒸发除去溶剂，即得ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯。２．１．３．２脂肪酸组成分析［６０，６１］样品的甲酯化：将０．５９样品放入一具塞试管中，加入５ｍＬ０．５ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钾的甲醇溶液（２．８９氢氧化钾溶于１００ｍＬ甲醇中）。在５０。Ｃ水浴中震荡３０ｍｉｎ，直至油滴消失，取出向混合物中加入５ｍＬ正己烷，震荡然后静止２分钟。取上清液然后加入适量无水硫酸钠脱除水分，贮存于试剂瓶中（－２０。Ｃ），供气相色谱分析用。气相分析条件：岛津ＧＣ．１４Ｂ气相色谱仪；色谱柱：ＦＦＡＰ石英毛细管柱（中科院大连化物所），３０ｍｘ０．２５ｍｍ（内径）×Ｏ．２５ｕｍ（膜厚）：检测器ＦＩＤ：进样口温度２５０。Ｃ，检测器温度２５０＂Ｃ；色谱柱升温程序：１９０４Ｃ保留１５ｍｉｎ，以５。Ｃ／ｍｉｎ升至２３０４Ｃ，直到分析完成；载气为氮气，压力５００ｋＰａ，空气压力５０ｋＰａ，氢气压力５０ｋＰａ，尾吹气压力２００ｋＰａ：分流方式进样，分流比４０：１，进样量１ｕＬ。脂肪酸的定性与定量：将脂肪酸甲酯的标准品的标准液和样品甲酯化后的溶液在相同条件下分别进样，进样量为ｌｕＬ，以脂肪酸甲酯的标准样品峰的保留时间进行定性，确定样品中的脂肪酸甲酯的样品峰，用面积百分比法进行定量（不计溶剂峰面积），以确定各种脂肪酸的相对百分含量。２．１‘３．３数据处理：采用ＳＡＳ数据处理软件２１２结果与讨论酶作为一种具有活性的物质，其作用效率受多种因素的影响，本研究考查了酶种类、油水比、加酶量、水解温度、激活剂、有机溶剂、缓冲溶液、反应时间对ＤＨＡ、ＥＰ：Ａ浓度的影响。脂肪酶水解鱼油富集ＤＨＡ、ＥＰＡ甘油酯的研究２．２．１不同来源的脂肪酶对ＤＨＡ、ＥＰＡ富集效果的影响本研究以２．００９鱼油为原料，加水２ｍＬ和正己烷３ｍＬ，在４０。Ｃ下反应１０ｈ，充氮气保护，研究不同来源的脂肪酶对ＤＨＡ、ＥＰＡ富集效果的影响。∞踮∞弱加坫ｍ０Ｏｌ—ＯＦ孔１００ＬＴＬＩＭ４３５酶酶的种类图２－１不同脂肪酶对ＤＨＡ、ＥＰＡ含量的影响Ｆｉｇ２－１ＥｆｆｅｃｔｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｉｐａｓｅｏｎｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆＤＨＡａｎｄＥＰＡ油脂具有三个不同位嚣的酯键，按次序从上而下编为ｌ、２、３。按费歇尔的投影式，把１，３位的酯键放在右边，把２位的酯键放在左边。从位置来看，这三个酯键是有立体差异的。脂肪酶对１、３位不能区分，常把ｌ、３位称为ａ位，２位称为１３位。大多数微生物脂肪酶作用于甘油三酯的ａ位，有位置专一性：但也有的脂肪酶无位置专一性，既能水解ａ位也能水解Ｂ位酯键。从图２．１可以看出，脂肪酶ＯＦ和ＴＬ１００Ｌ对ＤＨＡ、ＥＰＡ浓度的提高效果较好，而脂肪酶ＴＬＩＭ和４３５两种酶对ＤＨＡ、ＥＰＡ含量的提高效果不明显。这可能由于脂肪酶ＴＬＩＭ在工业化生产中是用于酯交换的酶，该酶对水解效果不明显；脂肪酶４３５有很宽的底物专用性，既是一种有效的促进三酰基甘油酯水解的酶，又是可以促进范围很广的伯醇和仲醇与羧酸之间合成反应的一种酶，在本试验中，该酶可能催化合成的作用大于水解的作用，因此对ＤＨＡ、ＥＰＡ含量的提高效果不佳。脂肪酶ＯＦ和ＴＬ１００Ｌ对ＤＨＡ、ＥＰＡ浓度的提高效果较好，浓缩效果差别不大，因此以下试验中我们对脂肪酶ＯＦ和ＴＬ１００Ｌ的富集效果分别进行研究。本研究以２．００９鱼油为原料，加入脂肪酶ＯＦ或ＴＬ１００Ｌ的用量为１０，０００Ｕ／ｇ油，加正己烷３ｍＬ，在４０℃下反应１０ｈ，充氮气保护，研究不同水油比对ＤＨＡ、ＥＰＡ富集效果的影响。从图２．２中可以看出在脂肪酶ＯＦ的作用下，当水油比为４时，效果较好。水油比小于４时，ＤＨＡ和ＥＰＡ的总含量随水油比的增大而增大，水油比大于４时，ＤＨＡ１４２．２．２水油比对ＤＨＡ、ＥＰＡ富集效果的影响广东海洋大学硕士学位论文和ＥＰＡ的总含量略微下降，这可能是由于在一定范围内水分的增加可激活酶的活性，为反应起始提供水，水的微微升高会加速反应速度，但另一方面过量水的存在又会导致生成物反应中的大量副反应发生。因此，在反应开始及反应过程中，严格控制水分量是十分重要的。根据油脂水解反应理论，我们想得到ＤＨＡ或ＥＰＡ甘油酯是ｌｍｏｌ黄鳍金枪鱼鱼油、２ｍｏｌ水在脂肪酶作用下起反应，但脂肪酶水解鱼油的反应是可逆的，随着反应的进行，水相中的甘油单酯浓度会增加，逆合成作用也逐渐加强，至甘油单酯浓度达到３０％，油酯水解反应就严重受阻。所以实际使用的水量要大于计算值。∞％∞嘶的蛎蚰∞２３４５６水油比图２－２在脂肪酶ＯＦ的作用下水油比对ＤＨＡ、ＥＰＡ总含量的影晌Ｆｉｇ２－２Ｅｆｆｅｃｔｏｆｔｈｅｒａｔｉｏｏｆｗａｔｅｒｔｏｏｉｌ０ｎｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆＤＨＡａｎｄＥＰＡｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄｂｙｌｉｐａｓｅＯＦ３９专３７删３５篓３３盆３１自２９暑２７。２５２３４５水油比图２－３在脂肪酶ＴＬＩＯＯＬ作用下水油比对ＤＨＡ、ＥＰＡ总含量的影响Ｆｉ９２－３ＥｆｆｅｃｔｏｆｔｈｅｒａｔｉｏｏｆｗａｔｅｒｔｏｏｉｌｏｎｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆＤＨＡａｎｄＥＰＡｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄｂｙｌｉｐａｓｅＴＬＩＯＯＬ从图２—３中可以看出在脂肪酶ＴＬｌＯＯＬ的作用下，ＤＨＡ和ＥＰＡ的总含量随水油比的增大而明显降低，这可能是该脂肪酶在水中酶颗粒崩解，催化作用减弱。从上述分析结果可以明显看出，脂肪酶ＯＦ在最佳的水油比下对ＤＨＡ、ＥＰＡ的富集效果明显好于脂肪酶ＴＬ１００Ｌ，因此以下的研究中选择脂肪酶ＯＦ，水油比为４。脂肪酶水解鱼油富集ＤＨＡ、ＥＰＡ甘油酯的研究２．２．３酶浓度对ＤＨＡ、ＥＰＡ富集效果的影响本研究以２．００９鱼油为原料，加水８ｍＬ和正己烷３ｍＬ，在４０。Ｃ下反应１０ｈ，充氮气保护，在脂肪酶ＯＦ的作用下研究不同酶浓度对ＤＨＡ、ＥＰＡ富集效果的影响。５０．女－ｘ孟４５篓４０善３５童３０５富２５０ｌ２３４１０２０酶浓度（ｒａｇ／ｇ油）图２－４酶浓度对ＤＨＡ、ＥＰＡ总含量的影响Ｆｉｇ２－４ＥｆｆｅｃｔｏｆｅｎｚｙｍｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｎｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆＤＨＡａｎｄＥＰＡ从图２－４可以看出，酶浓度为１５ｍｇ／ｇ油时效果较好。在脂肪酶浓度为０－２ｍｇ／ｇ油时，ＤＨＡ和ＥＰＡ的总含量随着酶浓度的升高明显增加；在脂肪酶浓度为２－１０ｍｇ／ｇ油时，ＤＨＡ和ＥＰＡ的总含量随着酶浓度的升高而增加不明显；在脂肪酶浓度为１０－１５ｍｇ／ｇ油时，ＤＨＡ和ＥＰＡ的总含量随着酶浓度的升高而增加较为明显；在脂肪酶浓度大于１５ｍｇ／ｇ油时，ＤＨＡ和ＥＰＡ的总含量逐渐趋于稳定。脂肪酶用量太少或太多，水解效果都不好，甚至难以使产物中甘油酯含量达到要求。当脂肪酶用量太少时，酶的活力不足以使甘油酯水解到所要求的程度；但此时若适当提高脂肪酶的用量，水解效率则会显著提高。当脂肪酶用量较大时，产物对酶的抑制作用等不利因素在反应中起主导作用，使水解效率降低。在工业生产中，须参考具体反应体系、操作条件及酶的价格等诸多因素，选择适宜的脂肪酶用量，以获取最好的经济效益。例如酶用量较低时，可以采取加强搅拌、延长水解反应时间等方法加以弥补。因此，综合考虑，以下研究选择酶浓度为１５ｍｇ／ｇ油。２．２．４温度对ＤＨＡ、ＥＰＡ富集效果的影响本研究以２．００９鱼油为原料，加水８ｍＬ和正己烷３ｍＬ，脂肪酶ＯＦ浓度为１５ｍｇ／ｇ油，反应１０ｈ，充氮保护，研究不同反应温度对ＤＨＡ、ＥＰＡ富集效果的影响。从图２．５可以看出，脂肪酶ＯＦ在温度为４０℃时，催化效果最好，ＤＨＡ和ＥＰＡ的总含量最高。在体系温度低于４００Ｃ时，ＤＨＡ和ＥＰＡ的总含量随温度升高而增大，在体系温度高于４０＂Ｃ时，ＤＨＡ和ＥＰＡ的总含量下降很快，这可能是温度对脂肪酶酶促鱼油水解反应的影响较复杂，温度升高对酶促反应产生两种相反的效果。一方面，１６广东海洋大学硕士学位论文反应速度随温度升高而加快，这表现在０℃一４０。Ｃ范围内，ＤＨＡ和ＥＰＡ的总含量随温度升高而增加。另一方面，脂肪酶变性失活的速度随温度升高也迅速增加，在超过酶的适宜温度范围时，酶失活的速度比反应速度大得多，从而使水解反应速度急剧下降，这表现在４０＂Ｃ．７０＊Ｏ范围内，ＤＨＡ和ＥＰＡ的总含量随温度升高而降低。因此，以下研究选择反应温度为４０００。∞踮的蛎鲫∞髂∞３０４０５０６０７０温度（℃）图２－５温度对ＤＨＡ、ＥＰＡ总含量的影响Ｆｉ９２－５ＥｆｆｂｃｔｏｆｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅＯｉｌｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆＤＨＡａｎｄＥＰＡ２．２．５添加剂对ＤＨＡ、ＥＰＡ富集效果的影响本研究以２．００９鱼油为原料，加水８ｍＬ和正己烷３ｍＬ，脂肪酶ＯＦ浓度为１５ｍｇ／ｇ油，在４０。Ｃ下反应ｌＯｈ，充氮气保护，研究不同的添加剂种类对ＤＨＡ、ＥＰＡ富集效果的影响。５８Ｓ５６鳝ｇ４８麦４６嚣４４叠４２。４０空白氯化钙氯化钠碳酸钠氯化镁氯化钾激活剂的种类图２－６激活剂对ＤＨＡ、ＥＰＡ总含量的影响Ｆｉ９２－６ＥｆｆｅｃｔｏｆａｃｔｉｖａｔｏｒｏｎｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆＤＨＡａｎｄＥＰＡ从图２－６可以看出，在添加氯化钾的情况下，ＤＨＡ和ＥＰＡ的总含量有所提高，而氯化钙、氯化钠、碳酸钠和氯化镁，对ＤＨＡ和ＥＰＡ的富集起抑制作用。这可能是Ｋ十对脂肪酶ＯＦ起激活作用，而其它离子Ｎａ＋、Ｃａ２＋、Ｍ９２＋对脂肪酶ＯＦ起抑制作用。脂肪酶水解鱼油富集ＤＨＡ、ＥＰＡ甘油酯的研究氯化钾对脂肪酶ＯＦ的催化虽然有一定激活作用，但是效果并不明显。如果在反应体系中添加了氯化钟，在水解后进行产物分离的过程中还需要除去金属盐类，增加了操作工序，而且容易造成ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯的损失，因此，综合考虑，以下研究中不添加激活剂。２＋２．６有机溶剂对ＤＨＡ、ＥＰＡ富集效果的影响本研究以２．００９鱼油为原料，加水８ｍＬ，脂肪酶ＯＦ浓度为１５ｍｇ／ｇ油，在４０“Ｃ下反应１０ｈ，充氮气保护，研究不同的有机溶剂种类对ＤＨＡ、ＥＰＡ富集效果的影响。Ｓ６７。０篓器喜ｉ：喜１：空白｜ｌ＿¨．ｕ异辛烷正己烷正庚烷丙酮有机溶剂种类ｏｎ氯仿图２．７有机溶剂的种类对ＤＨＡ、ＥＰＡ总含量的影响Ｆｉｇ２－７ＥｆｆｅｃｔｏｆｏｒｇａｎｉｃｓｏｌｖｅｎｔｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆＤＨＡａｎｄＥＰＡ脂肪酶催化油脂水解是水油两相的反应体系，水油互不相溶，为了增加其脂肪酶与两种底物的充分接触，本研究尝试采用添加有机溶剂来促进脂肪酶催化油脂水解反应。从图２．７中可以看出有机溶剂对催化效果的影响，添加丙酮、氯仿等溶剂，ＤＨＡ和ＥＰＡ的总含量大量减少：添加异辛烷、正己烷、正庚烷等弱极性或非极性的溶剂，ＤＨＡ和ＥＰＡ的总含量有所增加，但是和不添加有机溶剂的相比，效果并不明显。高桥穰二等研究了脂肪酶在水．有机溶剂双相体系中催化油脂水解的反应，发现了水解效果与溶剂性质之间的相关性，但并不十分明确其原因。他们用溶剂的溶解参数（６）比较好地描述了这一相关性，６值越小，即与水相溶性越小，促进水解效果越高。有机溶剂的添加量对水解率也有明显的影响。添加适量的异辛烷，不仅能提高油脂水解率，而且有利于酶的回收。Ｆｅａｒｉｒｈｅｌｌｅｒ．Ｓ．Ｈ等在用固定化酶水解牛脂时添加非极性溶剂，反应速度至少提高２倍。然而本试验由于有机溶剂对ＤＨＡ和ＥＰＡ的总含量的提高效果不是很明显，并且考虑到食品的安全性，因此以下研究中不添加有机溶剂。２．２．７ＤＨ对ＤＨＡ、ＥＰＡ富集效果的影响本研究以２．００９鱼油为原料，加缓冲溶液８ｍＬ，脂肪酶ＯＦ浓度为１５ｍｇ／ｇ油，在４０＂Ｃ下反应１０ｈ，充氮气保护，研究不同ｐＨ值的缓冲溶液对ＤＨＡ、ＥＰＡ富集效广东海洋大学硕士学位论文果的影响。５８誉５６袈５４霎５２基５０璧４８Ｚｏ４６—－…一水４６５７８９１０缓冲溶液ｐＨ值图２－８缓冲溶液ｐＨ对ＤＨＡ、ＥＰＡ总含量的影响Ｆｉｇ２－８ＥｆｆｅｃｔｏｆｂｕｆｆｅｒｓｏｌｕｔｉｏｎｐＨｏｎｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆＤＨＡａｎｄＥＰＡ从图２．８可以看出，用ｐＨ＝７的缓冲液时酶的水解效果最好，ＤＨＡ、Ｅ墩．的总含量最高，在缓冲溶液ｐＨ为４．７时，ＤＨＡ、ＥＰＡ的总含量随缓冲溶液ｐＨ的增大而增大，在缓冲溶液ｐＨ为７．１０时，ＤＨＡ、ＥＰＡ的总含量随缓冲溶液ｐＨ的增大而减小。当加入缓冲溶液ｐＨ为７时，用ｐＨ试纸测水解前后反应体系的ｐＨ，反应前为７．０，反应后为６．５，而脂肪酶ＯＦ的最适ｐＨ范围为６—７，整个反应过程都基本处于酶的最佳ｐＨ范围内。在此最佳ｐＨ范围内，酶分子的空间结构的有关基团处于最佳解离状态，最有利于与底物结合并发生催化作用，活力最高。因此，在以下的试验中使用ｐＨ为７的缓冲溶液，而不再添加水。２．２．８反应时间对ＤＨＡ、ＥＰＡ富集效果的影响本研究以２．００９鱼油为原料，加ｐＨ为７的缓冲溶液８ｍＬ，脂肪酶ＯＦ浓度为１５ｍｇ／ｇ油，充氮气保护，在４０＂Ｃ下反应，研究不同反应时间对ＤＨＡ、ＥＰＡ富集效果的影响。７５芭７０臻６５要６０蛊５５量５０ｏ４５４８１２１６２０２４３０４０５０反应时间（ｈ）图２－９反应时间对ＤＨＡ、ＥＰＡ总含量的影响Ｆｉｇ２－９Ｅｆｆｅｃｔｏｆｒｅａｃｔｉｏｎｔｉｍｅ１９ｏｎｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆＤＨＡａｎｄＥＰＡ脂肪酶水解鱼油富集ＤＨＡ、ＥＰＡ甘油酯的研究从图２－９可以看出，水解反应进行２４小时之后，曲线趋于平缓，ＤＨＡ、ＥＰＡ的总含量达到最高，水解反应在０．２４小时之内，随反应时问的延长，ＤＨＡ、ＥＰＡ的总含量不断升高。反应时间长是脂肪酶催化油脂水解反应的缺点之一。在理论上，反应时问越长，甘油酯水解会越彻底。但是从工业生产角度考虑，总是希望反应时间越短越好。根据生产要求，选择水解反应时间为２４小时较适宜。２．２．９工艺参数的优化通过单因素试验，我们初步确定了如下水解工艺参数：脂肪酶ＯＦ；缓冲液ｐＨ为７．０；水油比为４；酶浓度为１５ｍｇ／ｇ油；在４０＂Ｃ的条件下反应２４ｄ＇时。在单因素分析的基础上采用四因素响应面试验设计（ＲｅｓｐｏｎｓｅＳｕｒｆａｃｅＭｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ，ＲＳＭ），对油水比例、缓冲溶液的ｐＨ、酶浓度和反应温度等四个工艺参数进行优化。２．２．９．１响应面试验设计旧”１以油水比例（Ｘ１）、缓冲溶液的ｐＨ（Ｘｚ）、酶浓度（Ｘ３）和反应温度（Ｘ４）为决定变量因素，以反应产物中ＤＨＡ和ＥＰＡ的总含量（Ｙ）为响应变量，采用四因素响应面试验设计。除了在中心点进行３次重复试验外，其它每个试验点重复２次，中心点的重复是为了估计整个试验过程中的纯误差。所有试验均以随机化顺序进行，以避免其它因素的影响。利用二次多项式回归模型来预测响应变量Ｙ，该模型的基本形式如下：Ｙ＝鳓ｍ＃∑脯ｑｗ∑嘏斗∑∑如ｘ尚岛，屈，居，岛分别为回归模型的截距、一次项、平方项和交叉项的回归系数，ｘｉ和Ｘｉ是决定变量，Ｙ为响应变量。利用ＳＡＳ中ＲＳＲＥＧ过程进行多元回归（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）分析、方差（Ｖａｒｉａｎｃｅ）分析、Ｃａｎｎｏｎｉｃａｌ分析等。利用上述分析可得到二次多项式数学模型，通过使其中一个决定变量保持在对响应变量影响最小的值也即中心点，改变其它两个变量的水平，来描绘各个响应变量的响应曲面图和等高线图，从而得出响应变量随着决定变量的变化发展趋势，以及该模型是否具有极大值，还是极小值，还是鞍点，最终优化出最佳的因素水平组合。因素水平编码表如表２－ｌ。表２—１因素水平编码表！竺丝：：！兰２璺！坚：！！坚！！墅塑堡竺兰！：弓ｘｌｘ２ｘ３）（４编码变量水平油水比缓冲液的ｐＨ酶浓度（ｍｇ／ｇ）温度（℃）广东海洋大学硕士学位论文！！＝＝！＝＝！！＝｜｝，●＿ＥＥＥ＝＝＝＝＝＝！！＝！＝＝＝＝＝＝Ｅ＝｜＿＿＿ｅ｜自自！！＝＝＝！！！！Ｅ！！！＝＝＝＝ｊ＝！＝＿Ｅ＿●－＿ＩＩＩ。＝＝！＝皇２．２．９．２酶促水解反应的数学模型分析根据表２—１的因素和水平进行响应面试验设计，按照设计的试验点进行试验，测得各因素水平组合下的ＤＨＡ和ＥＰＡ总含量（Ｙ）如表２－２。表２．２试验设计方案与结果Ｔａｂｌｅ２－２Ｓｃｈｅｍｅａｎｄｒｅｓｕｌｔｓｏｆｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ油水比ｎＨ酶浓度温度ＤＨＡ和ＥＰＡ试验号ＺｉＺ４ｚ，Ｚ１Ｚ总含量（Ｙ，％）总岔蕈（ｔ％）１－１．１００５２．６３２－１１００３０，８４３１．１００５４．４０４１１００３１．９２５００．１—１５３．３９６００－１１２９．７５７００１．１５７．０８８００ｌ１３５．２５９．１００－１５５．９６１０－１００１３１．９３１１１００－１５７．９９１２１００１３６．９５１３０．１．１０５１．６３１４０－１１０５４．２３１５０ｌ－１０３１．５０１６０ｌ１０３ｔ．７８１７．１０－１０３３．９６１８－１０１０４２．５７１９１０－１０３７．０９２０１０ｌ０６０．３９２１０．１０－１４９．８１２２０－１０Ｉ３７。８１２３０ｌ０－１３１．８５２４０ｌ０ｌ２９．８３２５００００５６．３３２６００００５４．６６２７００００５３．２０２１脂肪酶水解鱼油富集ＤＨＡ、ＥＰＡ甘油酯的研究对试验结果进行因素方差分析，结果见表２．３。从表２－３可以看出缓冲溶液ｐＨ（ＺＤ和反应温度（磊）对响应变量ＤＨＡ和ＥＰＡ总含量（Ｙ）的影响是极显著的，油水比（Ｚｉ）和酶浓度（ｚ３）对响应变量ＤＨＡ和ＥＰＡ总含量（Ｙ）的影响是不显著的。表２－３因素的方差分析：：：翌塑！！竺坐塑竺：！变量因素ＺｌＺ２Ｚ３自由度平方和２２３．４７１５０５．０４３５３．８５均方４４．６９３０１．０ｌ７０．７７Ｆ值１．２３８．２７１．９５Ｐ值０．３５０．００ｌ０．１６垒！：！！！：型！：：！！：！竺注：Ｐ＜０．０１为极显著，Ｏ．０１＜Ｐ＜ｏ．０５为显著，Ｐ＞Ｏ，０５不显著。表２＾４响应变量＝次多项式模型的回归系数Ｔａｂｌｅ２．４ＲｅｇｒｅｓｓｉｏｎｔｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓｏｆｐｒｅｄｉｃａｔｅｄｓｅｃｏｎｄｄａｒｄｅｒｐｏｌｙｎｏｍｉａｌｍｏｄｅＩｆｏｒｒｅｓｐｏｎｓｅｖａｒｉａｂｌｅｓ变量回归系数（Ｂ）５４．７３２．５７－９．３９Ｔ检验Ｐ值１５．７２１．４８截距一次项ＺｌＺ，Ｚ，Ｚ＾０．０００Ｏ．１７０．０００２Ｏ．０６Ｏ．０００３Ｏ．１５０．００５Ｏ．０８０．０３—５．４０２．１１３．６６．８．７１－４．０６－５．００－１．５５—３．３９－１．９４－２．４７平方项Ｚｌｌｚ２２Ｚ３３Ｚ４４－８．８６－５．０６－６．４４－Ｏ．１７交叉项ｚ１２Ｚ１３Ｚ１４·Ｏ．０６１．２２０．２５—０．１９Ｏ．９６Ｏ．２５Ｏ．８ｌＯ．８５０．４２Ｏ．８８３．６７Ｏ．７５一Ｏ．５８２．５０Ｏ．４５ｏ．８７Ｚ２３ｚ２４ｚ３４０．８３０．１５Ｒ２注：Ｐ＜０．０１极显著；Ｐ＜０．０５显著：Ｐ＞０．０５不显著响应变量的二次多项式模型的回归系数如表２－４所示，各项系数经ｔ．检验得缓冲溶液ｐＨ（ＺＤ和反应温度（ｚ４）的一次项和二次项对ＤＦＬＡ和ＥＰＡ的总含量（Ｙ）影２２广东海洋大学硕士学位论文响都呈极显著；其它因素的一次项和二次项以及四个因素之间的交互作用均不显著。这说明ＤＨＡ和ＥＰＡ的总含量是由缓冲溶液ｐＨ和反应温度的一次项和二次项所决定。试验因素对响应变量的影响经过回归拟合，去除不显著的因素项后可用如下二次多项式表示：Ｙ２５４．７３－９．３９ｚ２—８．７１Ｚ４—８．８６乏一６．４４霉对该模型进行方差分析，结果见表２．５。从表２．５可以看出对响应变量Ｙ起决定作用主要是一次项和平方项，它们对数学模型的贡献率分别为６８％和１６％：交叉项也就是因素之间的交互作用是不显著的；回归方程呈极显著，决定系数Ｒ２为Ｏ．８６，达到了比较好的水平。对数学模型进行失拟性检验，结果见表２－６。从表２－６可以看出失拟项不显著（Ｐ＞０．０５）。决定系数和失拟性检验的结果表明：该模型与实际情况拟合程度比较高。Ｔａｂｌｅ２－５、嘶ａ１１ｃｅ表２－５回归模型的方莓霉笺ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｒｅｇ÷蔷ｓｉｏ署蠢萄ｅ１注：Ｐ＜Ｏ．Ｏｌ为极显著，ｏ．０１＜Ｐ＜０．０５为显著，Ｐ＞Ｏ．０５不显著表２－６回归模型的误差分析Ｔａｂｌｅ２－６Ｅｒｒｏｒａｎａｌｙｓｉｓｏｆｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｍｏｄｅ２．２．９．３数学模型的稳定点分析稳定点的分析可用数学方法来求解。如果一个函数的稳定点存在，它应该使其对每个决定变量的偏导数分别为零，这样可以联立一个方程组，求出该稳定点。利用此方法求出四个数学模型的稳定点的坐标为（０．５１，．０．６６，Ｏ．５５，．Ｏ．７６）。稳定点的坐标在试验的区域（一１，１）之内，由此得到相应的预测值为６２．７９％。为了找出稳定点的特征，可以首先利用坐标变换，将模型用一个新的坐标系表示，脂肪酶水解鱼油富集ＤＨＡ、ＥＰＡ甘油酯的研究它的原点在稳定点ｚ。处，然后作坐标轴旋转，直至它们与拟合曲面的主轴平行为止，这样得到模型的正则形式为：Ｙ＝６２．７９－２．６１∞；－５．９１【Ｉ）２２－６．４８（＾）；一９．４２ｃｏ：从模型的正则形式的各个变量的系数的符号可以看出，Ｙ具有最大值。对于二次多元回归模型，响应变量和决定变量之间的关系都可用一个三维响应曲面图和一个二维等高线图来描述。从三维响应曲面图上可以清楚地看出，响应变量随寿决定变量变化的变化趋势，并能看出该模型是具有极大值，还是极小值还是鞍点。模型中决定变量对响应变量ＤＨＡ和ＥＰＡ总含量（Ｙ）的三维响应曲面图和二维等高线图见图２．１０。从图２．１０的三维曲面图和等高线图可以直观的看出ＤＨＡ和ＥＰＡ总含量应具有最大值，因素对ＤＨＡ和ＥＰＡ含量的影响趋势均为先增大后减小。图２．１０缓冲溶液ｐＨ值和温度对ＤＨＡ和ＥＰＡ总含量的响应面图和等高线图Ｆｉｇ２－１０ＲｅｓｐｏｎｓｅｓｕｒｆａｃｅａｎｄｃｏｎｔｏｕｒｐｌｏｔｓｆｏｒｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｓｕｆｆｅｒｐＨａｎｄｔｈｅｒｅａｃｔｉｏｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ前面的分析中ｚｊ是因素的编码值，将规范变量ｚｊ用自然变量ｘｊ表示，数学模型即为：Ｙ＝一１５１．７８＋５２．８４Ｘ２＋２．００Ｘ４—３．９４Ｘ；一ｏ．０３Ｘ；稳定点的坐标也即变换为（４，６．５，１９．８３，３３．６），也就是说，在油水比１：４、缓冲溶液ｐＨ为６．５、酶浓度为１９．８３ｍｇ／ｇ、反应温度为３３．６＂Ｃ的情况下，模型的最大预测值为６２．７９％。为了操作方便，选择在油水比ｌ：４、缓冲溶液ｐＨ为６．５、酶浓度为２０ｍｇ／ｇ、反应温度３５℃的情况下做验证试验，得到ＤＨＡ和ＥＰＡ总含量为６１．４８％，与预测值６０．０５％基本相符，误差仅为２％。这也说明了建立的数学模型的拟合程度比较高，在一定程度上可以用于预测反应的过程。２４广东海洋大学硕士学位论文２５２２２５。’。‘２２２２２２２２２。２２２２２５８５５２２２２５目＿·＿＿＿●＿牛‘－自Ｅ＝＝一２．３本章小结’本章在对单因素的试验结果分析的基础上，对脂肪酶选择性催化鱼油水解富集ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯的工艺参数采用四因素响应面试验设计进行优化，利用ＳＡＳ进行多元回归分析，获得了脂肪酶选择性水解富集ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯的二次多项式数学模型：Ｙ＝一１５１．７８＋５２．８４Ｘ，＋２．ＯＯＸ。一３．９４Ｘ；一ｏ．０３Ｘ：，优化出的工艺参数为：油水比为ｌ：４、缓冲溶液ｐＨ值６．５，酶浓度２０ｍｇ／ｇ油，反应温度为３５。Ｃ的情况下水解２４ｈ，通过试验验证，数学模型与实际情况拟合比较好。在此条件下获得的ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯中的ＤＨＡ和ＥＰＡ总含量可达６１．４８％，其中ＤＨＡ含量为５６．２２％，ＥＰＡ含量为５．２６％。脂肪酶水解鱼油富集ＤＨＡ、ＥＰＡ甘油酯的研究第三章ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯的理化性质和组成分析脂肪酶催化水解法有效的提高了甘油酯中ＤＨＡ、ＥＰＡ的含量，本章我们对ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯的理化性质和其组成进行分析，为开发新一代鱼油保健品提供基础数据。对黄鳍金枪鱼鱼油和经酶水解富集得到的ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯的理化性质进行比较分析，为产品的评价提供理论依据；对脂肪酸组成进行分析比较，可以看出脂肪酶作用的机理。对脂肪酶催化水解得到的ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯用硅胶柱层析技术对ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯的类型进行组分分离，然后经红外光谱（ＩＲ）对每一组分进行扫描，验证柱层析分离的效果。３．１材料与方法３．１．１试验材料黄鳍金枪鱼鱼油，ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯（按照第二章的工艺参数制取），脂肪酸甲酯标准品购自Ｓｉｇｍａ公司，主要有Ｃａ—Ｃ２４等多种脂肪酸甲酯（商品号１８９１９－１ＡＭＰ）。３．１．２试剂与仪器试剂名称纯度级别生产厂家氯仿ＡＲ广州化学试剂厂甲醇ＡＲ广州化学试剂厂正己烷ＡＲ广州化学试剂厂苯ＡＲ广州化学试剂厂邻苯二甲酸氢钾ＡＲ广东台山化工厂浓硫酸ＡＲ广州化学试剂厂乙醚ＡＲ广州化学试剂厂无水硫酸钠ＡＲ广州化学试剂厂氢氧化钠ＡＲ广州化学试剂厂９５％乙醇ＡＲ广州化学试剂厂冰乙酸ＡＲ广州化学试剂厂硫代硫酸钠ＡＲ广州化学试剂厂氯化钠ＡＲ广东台山化工厂氢氧化钾ＡＲ广东台山化工厂硅胶ＨＡＲ上海荧光化学厂２６广东海洋大学硕士学位论文仪器型号名称ＴＨＺ．８２型电热恒温震荡水浴槽ＦＡ２１生产厂家上海浦东跃欣科学仪器厂上海天平仪器厂上海托普仪器有限公司日本岛津上海浦东跃欣科学仪器厂只本岛津０４Ｓ型电子天平Ｎ１０００真空旋转蒸发仪ＧＣ．１４Ｂ１０１Ａ．２数显电热恒温鼓风干燥箱ＣＲ６Ａ记录仪２．６ｃｍ＊３０ｃｍ层析柱ＳｐｅｃｔｒｕｍＧＸ型傅立叶变换红外光谱仪上海沪西仪器厂美国ＰＥ公司３．１．３试验方法３．１．３．１鱼油理化性质的测定（１）酸值的测定：ＧＢ／Ｔ５５３０．１９９８［删（２）过氧化值的测定：ＧＢｆｒ５５３８．１９９５［６５】（３）皂化值的测定：ＧＢ／Ｔ５５３４．１９９５［６６１（４）碘值的测定：ＧＢ／Ｔ５５３２—１９９５【６７Ｊ３．１．３，２脂肪酸组成分析：具体方法同第二章。３．１．３＿３ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯的分离（１）称３０９处理好的硅胶于１５０ｍｌ烧杯中，加入５０－６０ｍｌ石油醚，用玻璃棒轻轻搅拌排除气泡。将上述匀浆通过一个漏斗转移至色谱注中，打开下端的开关，使液体流出，要保证色谱柱中的液面高于硅胶２ｃｍ。用少量的石油醚冲洗烧杯和漏斗，同样转移至色谱柱中。硅胶沉积好后，要保持色谱柱中的液面位置高于硅胶２ｃｍ。（２）上样：小心将制备好的样品加到色谱柱上，打开色谱柱下面的开关，调整洗脱速度为２ｍｌ／ｍｉｎ。然后用５ｍｌ氯仿冲洗样品烧杯，将洗液同样加到色谱柱上。当液面降至硅胶上２ｃｍ处。弃去洗出液。（３）洗脱向色谱柱上加２００ｍｌ苯，用５００ｍｌ的烧瓶收集。这部分洗脱液既包含有甘油三酯部分。当液面降至硅胶上２ｅｍ处时，向色谱柱中加入２００ｍｌ的乙醚和苯的混合溶液（１：９，ｖ／ｖ），用５００ｍｌ的烧瓶收集。这部分包含有甘油二酯和游离的脂肪酸。当液面降至硅胶上２ｃｍ处时，向色谱柱中加入２００ｍｌ的乙醚，用５００ｍｌ的烧瓶收集。这部分含有甘油单酯。为了检验是否洗脱完毕，可再用５００ｍｌ的烧瓶收集５０ｍｌ的乙醚。用旋转蒸发仪除去各部分的溶剂，然后用氯仿将残留物分别转移至５０ｍｌ的烧瓶（已知质量）中，在热水浴上挥去溶剂，室温下冷却１５ｍｉｎ，称重。在加热５ｍｉｎ，称重，这样连续几次，直到连续两次的质量之差在２ｍｇ范围之内。２７脂肪酶水解鱼油富集ＤＨＡ、ＥＰＡ甘油酯的研究甘油三酯（％）：——型生一ＭＭ２。ｌｏｏ甘油二酯（％）＝ＭＭ３×１００甘油单酯（％）＝Ｍ×１００ＭＩ：苯洗脱部分的质量；Ｍ２：乙醚和苯的混合溶液洗脱部分的质量；Ｍ３：乙醚沈脱部分的质量：Ｍ：上样的质量。３．１．３．４傅立叶变换红外光谱分析利用ＳｐｅｃｔｒｕｍＧＸ型傅立叶变换红外光谱仪对分离的三类组分甘油三酯，甘油二酯，甘油一酯分别进行红外光谱分析。分析条件为：分辨率为８ｃｍ＂１，扫描次数５次，波数范围４０００－－４００ｃｍｌ。制样方法：ＫＢｒ压片法，是将ＫＢｒ和样品混合在～起，研磨，然后用油泵压成透明圆形薄片，取出来后用软磁铁固定后放入样品室测量。３．２结果与讨论３＿２．１ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯的理化性质表３一ｌＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯的理化性质Ｔａｂｌｅ３－１ＰｈｙｓｉｃａｌａｎｄｃｈｅｍｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｙｏｆＤＨＡａｎｄＥＰＡｇｌｙｃｅｒｉｄｅ注：参考鱼油标准为ＳＣ／Ｔ３５０２－２０００：过氧化值单位ｍｍｏｌ／ｋｇ是以ｌ彪（１２）为基本单位。对ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯的理化性质进行分析，并与天然鱼油和我国水产行业有关鱼油的标准进行了比较，结果见表３．１。从表３．１中看出黄鳍金枪鱼鱼油水解的产物ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯的理化指标仍然达到了我国水产行业标准规定的鱼油一级标准。表中还可以看出水解后甘油酯的酸值比较低，说明游离的脂肪酸含量比较低；过氧化值略高于水解前，充氮保护能有效的阻止多不饱和脂肪酸的氧化；皂化值反映的是脂肪酸混合物的平均分子量的大小，皂化值越小，平均分子量越大，水解后甘油酯的皂化值低予水解前鱼油，说明水解后甘油酯中脂肪酸的平均分子量比水解前鱼油中脂肪酸的平均分子量大，这是因为甘油酯中的脂肪酸主要是长链的ＰＵＦＡ，分子量比较大，而水解前鱼油中含有一定量的中碳链的脂肪酸，分子量相对较小。水解后甘油酯的碘广东海洋大学硕士学位论文值比较高，再次说明了水解后ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯中含有大量的不饱和双键，脂肪酸以多不饱和脂肪酸为主。３－２．２ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯的脂肪酸组成分析对ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯的脂肪酸组成进行气相色谱分析，并与天然的黄鳍金枪鱼鱼油进行比较，结果见图３—１和表３—２。从图３．１和表３．２中比较可以明显看出，黄鳍金枪鱼鱼油经水解后的甘油酯中一些饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸如Ｃ１４Ｃ旧ｌ等含量明显降低，ＤＨＡ含量明显提高，ＥＰＡ含量提高效果不明显。ＡＡＢｏ，Ｃｌ６＝ｏ，鲫ＯＡＨ队～＾～：ｄ。Ｌ眺６ｉ兮～和Ｉ』扎Ｊ～㈨止～一．Ｌ聃止一几一ＩＪ』０儿～Ａ：天然黄鳍金枪鱼鱼油；Ｂ：ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯图３－１ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯和黄鳍金枪鱼鱼油的脂肪酸组成Ｆｉｇ３－１ＦａｔｔｙａｃｉｄｓｃｏｍｐｉｌｅＯｆＤＨＡａｎｄＥＰＡｇｌｙｃｅｒｉｄｅｓａｎｄｙｅｌｌｏｗｆｉｎｔｕｎａｏｉｌ脂肪酶ＯＦ是一种不具有位置选择性的酶，从气相色谱图的比较来看，脂肪酶ＯＦ对各种脂肪酸的水解有一定差异，对ＤＨＡ的富集效果好于对ＥＰＡ的富集效果，这可能是由于脂肪酶ＯＦ对脂肪酸的水解具有一定的选择性，脂肪酸的链越长、双键越多就越难被脂肪酶ＯＦ水解掉，从而被富集在甘油酯中。在较佳的反应条件下，黄鳍金枪鱼鱼油经过脂肪酶ＯＦ的水解，甘油酯中ＤＨＡ的含量由反应前的２５．１０％提高至反应后的５６．２２％，ＥＰＡ的含量由反应前的４．４５％提高至反应后的５．２６％。有关脂肪酶对脂肪酸的选择性水解机理还需要进一步研究。３．２．３ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯的分离对ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯采用柱层析进行组分分离，结果见表３．３。柱层析分离甘油酯主要是利用甘油三酯、甘油二酯和甘油一酯在极性上的差别。甘油三酯是没有极性的，用非极性溶剂洗脱，甘油二酯极性稍弱，用非极性溶剂和极性稍弱的溶剂混合洗脱，甘油一酯用极性稍弱的溶剂洗脱。柱层析常用的固定相吸附剂是硅胶和氧化铝等。对ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯采用柱层析进行组分分离的结果见表３—３。２９脂肪酶水解鱼油富集ＤＨＡ、ＥＰＡ甘油酯的研究表３．２ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油醑和黄鳍金枪鱼鱼油的脂肪酸组成（相对百分含量，％）Ｔａｂｌｅ３－２ＦａｔｔｙａｃｉｄｓｃｏｍｐｉｌｅＯｆＤＨＡａｎｄＥＰＡｇｌｙｃｅｒｉｄｅａｎｄｙｅｌｌｏｗｆｉｎｔｕｎａｏｉｌ（ｒｅｌａｔｉｖｅｐｅｒｃｅｎｔ，嘞表３－３分离组分的含量ｊ兰！！！垡！翌竺坐！！！巴￡２１１坐分离物甘油三酯甘油＝酯甘油一酯含量（％）３５．２３６４．３２０．４５从表３－３中可以看出，ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯中的组分主要以甘油二酯为主，含量为６４．３２％；其次是甘油三酯和甘油一酯，含量分别为３５．２３％和０．４５％。ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯中的组成主要与脂肪酶水解的程度有很大关系。广东海洋大学硕士学位论文３．２．４傅立叶变换红外光谱分析图３－２甘油三酯的红外光谱Ｆｉｇ３－２Ｉｎｆｒａｒｅｄａｂｓｏｒｐｔｉｏｎｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙｏｆｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ图３－３甘油二酯的红外光谱Ｆｉｇ３－３Ｉｎｆｒａｒｅｄａｂｓｏｒｐｔｉｏｎｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙｏｆｄｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ‘¨●■ｌ¨●图３４甘油一酯的红外光谱Ｆｉｇ３－４Ｉｎｆｒａｒｅｄａｂｓｏｒｐｔｉｏｎｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙｏｆｍｏｎｏｇｌｙｅｅｒｉｄｅ３ｌ脂肪酶水解鱼油富集ＤＨＡ、ＥＰＡ甘油酯的研究对通过柱层析法分离得到的甘油三酯、甘油二酯和甘油一酯，进行红外光谱测定。甘油一酯分子中含有两个羟基（．ＯＨ），甘油二酯分子中含有一个羟基（．ＯＨ），这两种物质应在３３００ｃｍｏ附近呈现一个又宽又强的吸收峰，利用峰的面积大小可判断羟基的数量，甘油～酯分子中羟基的峰面积大约应为甘油二酯分子中羟基峰面积的２倍。甘油三酯分子中无羟基（．ＯＨ）存在，因此在３３００ｃｍ“附近处没有吸收峰。甘油酯中有羰基（Ｃ＝Ｏ），应在１７４５ｃｍｌ附近有强的吸收峰；分子中的．Ｃ…Ｏ１０００Ｃ，应在ｃｍｌ～１３００ｃｍｌ区域中有两个吸收峰，在１３００ｃｍ－ｌ～１１５０ｃｍ’１处为强的吸收峰，ｃｍ－Ｉ１０３０是不对称伸缩振动，在１１４０ｃｍ“处为较弱的吸收峰，是对称伸缩振动，这两类峰是判断分子中是否有酯键的重要依据【６８１。对ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯中甘油三酯、甘油二酯和甘油一酯的傅立叶变换红外光谱分析分别见图３．２、３．３和３－４。从图中可以看出，这三类物质分子在３０００ｃｍｌ～４００ｃｍｏ范围的吸收特征相似，在１７４５ｃｍ～，１３００ｃｍ－ｌ＿１１５０ｃｍ。和１１４０ｅｍ－Ｉ～１０３０ｃｍ。处都有特征吸收，这表明了这三类物质都是酯类物质；谱图中的最大不同是在３３００ｃｍ。处的吸收特征，可以明显看出甘油三酯在此处几乎没有吸收，表明了分子中没有羟基（一ＯＨ）的存在，而甘油二酯和甘油一酯在此处都有明显的吸收，表明了这两类物质分子中有羟基的存在（．ＯＨ），还可以明显看出，它们在此处吸收峰的面积有比较大的差异，甘油一酯的峰面积大约是甘油二酯的峰面积的２倍，这也充分表明，甘油一酯分子中存在两个羟基而甘油二酯分子中存在一个羟基。这些结果都表明，ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯的组成有甘油一酯、甘油二酯和甘油三酯，而且通过硅胶柱层析得到了很好的分离。３．３本章小结对ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯理化性质分析结果表明ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯达到了我国水产。行业标准规定的鱼油一级标准。ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯的脂肪酸组成特点为：饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸含量较低，Ｃ１４，ｏ，Ｃ１６＝０和ｃ１８：ｏ含量分别为１．０４％、７．４００，４、１．３９０，４，Ｃ１６ｌ和Ｃｉ８ｌ含量分别为３．０１％、ｌ１．６９０，４，主要以多不饱和腊肪酸为主，总含量为７０．６３％，其中ＤＨＡ和ＥＰＡ的含量分别为５６．２２％和５．２６％。ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯经硅胶柱层析分离并利用傅立时近红外光谱鉴定，结果表明：ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯中的组分主要以甘油二酯为主，含量为６４．３２％；其次是甘油三酯和甘油一酯，含量分别为３５．２３％和０．４５％。通过对黄鲳金枪鱼鱼油和ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯的脂肪酸组成进行分析比较可以推断，脂肪酶ＯＦ对鱼油中脂肪酸的水解可能具有～定的选择性，饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸如Ｃ伸０、Ｃ１６；ｏ、Ｃ１８。ｌ容易被水解：对ＤＨＡ的富集效果好于对ＥＰＡ的富集效果，这可能是由于脂肪酶ＯＦ对脂肪酸的水解具有一定的选择性，脂肪酸的链越长、双键越多就越难被脂肪酶ＯＦ水解掉，从而被富集在甘油酯中。有关脂肪酶对脂肪酸的选择性水解机理还需要进～步研究。广东海洋大学硕士学位论文第四章脂肪酶催化鱼油水解反应动力学的研究酶促反应动力学是研究酶促反应的速率以及影响此速率的各种因素的科学。在研究酶的作用机制时，需要动力学提供试验证据；为了发挥酶催化反应的高效率，寻找最有力的反应条件；为了了解酶在代谢中的作用，都需要掌握酶促反应速率的规律。因此，酶促反应动力学的研究既有重要的理论意义又具有一定的实践意义。本章研究了脂肪酶催化鱼油水解反应的动力学，得出了反应机理和动力学模型，并由试验数据得出了动力学参数。通过动力学研究，在理论上阐明酶促反应的机制，了解酶促反应的具体过程和途径。在实际应用上，可以根据反应速率来估计反应进行到某种程度所需的时间；也可以根据影响反应速率的因素进一步对反应进行控制。因此动力学的研究无论在理论上和实践中都是很重要的。４．１材料与方法４．１．１试验材料黄鳍金枪鱼鱼油４．１．２试剂与仪器试剂名称氯仿纯度级别ＡＲ生产厂家广州化学试剂厂广州化学试剂厂广州化学试剂厂广东台山化工厂广州化学试剂厂广州化学试剂厂广州化学试剂厂广州化学试剂厂广东台山化工厂甲醇正己烷邻苯二甲酸氢钾乙醚丙酮氢氧化钠９５％乙醇ＡＲＡＲＡＲＡＲＡＲＡＲＡＲ氢氧化钾ＡＲ仪器名称及型号ＦＡ２１０４型分析天平（０．０００１９）ＴＨＺ一８２型电热恒温震荡水浴槽１０１Ａ一２数显电热恒温鼓风干燥箱生产厂家上海天平厂上海浦东跃欣科学仪器厂上海浦东跃欣科学仪器厂脂肪酶水解鱼油富集ＤＨＡ、ＥＰＡ甘油酯的研究４．１．３试验方法４．１．３．１脂肪酶催化鱼油水解反应称取鱼油２．００９于５０ｍＬ锥形瓶中，加适量的酶，加入适量的水。充氮密封，放入恒温震荡水浴锅以１５０ｒ／ｍｉｎ的速度震荡反应，反应５ｍｉｎ后加１０ｍＬ乙醇和１０ｍＬ丙酮摇匀，使油样充分溶解后，加入２滴酚酞指示剂，用０．１ｍｏＩ／ＬＫＯＨ溶液滴定至微红色３０秽不消失为止，计算水解后体系的酸值。酸值：ｊ燮ｍｖ：滴定时所用氢氧化钾溶液的体积（ｍＬ）；ｅ：氢氧化钾溶液的浓度（ｍｏｌ／Ｌ）；１１１：油样的质量（ｇ）４．１．３．２反应动力学试验设计（１）以２．００９鱼油为原料，加４０ｍｇ脂肪酶ＯＦ，在３５。Ｃ下反应５ｍｉｎ，研究不同的底物浓度对反应速度的影响。（２）以２．００９鱼油为原料，加ｐＨ为６．５的缓冲溶液８ｍＬ，在３５。Ｃ下反应５ｍｉｎ，研究不同的酶浓度对反应速度的影响。（３）以２．００９鱼油为原料，加ｐＨ为６．５的缓冲溶液８ｍＬ，在４０ｍｇ脂肪酶ＯＦ的作用下，反应５ｍｉｎ，研究不同的反应温度对反应速度的影响。（４）以２．ＯＯｇ鱼油为原料，在４０ｍｇ脂肪酶ＯＦ的作用下，反应５ｍｉｎ，研究反应体系的ｐＨ对反应速度的影响。（５）根据试验所得数据按照赖氏双倒数方程作图，根据截距得出Ｖｍａｘ，然后求出Ｋｍ。反应速度＝—巫堕匿雩曩等产Ｅ＋ｓ≯１芷１Ｅｓ４．１．３．３Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ－Ｍｅｎｔｅｎ学说理论【６９１Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ－Ｍｅｎｔｅｎ学说的要点是他们假设有酶，底物中间产物的形成，并假设反应中底物转变成产物的速度取决于酶．底物复合物转变成反应产物和酶的速度，其关系如下：髫Ｅ＋ＰＥ为酶，ｓ为底物，ＥＳ为酶．底物复合物，Ｐ为产物，Ｋ１、臣１和施为三个假设过程的速度常数。广东海洋大学硕士学位论文设竺挚＝Ｋ。，Ｖｍａｘ＝Ｋ２【晶】’局为酶的总浓度，则：。：垡幽［Ｓ】＋Ｋ。这就是Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ．Ｍｅｎｔｅｎ方程，Ｊｏ为米氏常数，它是酶的一个重要参数。１当ｖ＝去％。时，则岛＝【司所以米氏常数Ｋｍ为反应速度达到最大速度一半时的底物浓度。测定墨，值有许多种方法，最常用的是Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ－Ｂｕｒｋ的双倒数作图法。取Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ．Ｍｅｎｔｅｎ方程的倒数，可得下式：！：坠。上＋上Ｖ‰。【踟‰。用ｙ＝ｌ／ｖ，ｘ＝ｌ／［ｓ］对该方程进行代换，即可得到相当于一直线方程的数学表达式：尸ｂｘ＋ａ，利用直线方程的截距和斜率即可求得‰和‰。。４．２结果与讨论４．２．１底物浓度对反应速率的影响Ｏ．１０Ｏ０Ｏ∞＼＿讲瑙Ｏ∞衄钾∞ｉ搔ｏ．０５０．０４ｏ—————————。—————。１７２０２５３３５０底物浓度（％）图４—１底物浓度对反应速率的影响Ｆｉｇ．４—１Ｅｆｆｅｃｔｓｕｂｓｔｒａｔｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｎｒｅａｃｔｉｏｎｒａｔｅ由图４．１可以看出，酶浓度保持不变，当底物浓度增加，反应初速度随之增加，并以双曲线形式达到最大速度。酶促反应速度并不是随着底物浓度的增加直线增加，而是在高浓度时达到一个极限速度。这时所有的酶分子已被底物所饱和，即酶分子与底物结合的部位已被占据，速度不再增加。这个问题可以用Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ与Ｍｅｎｔｅｎ于１９１３年提出的学说来解释。符合典型的米氏方程，进一步说明该酶促水解反应受动脂肪酶水解鱼油富集ＤＨＡ、ＥＰＡ甘油酯的研究力学所控制。４．２．２酶浓度对反应速率的影响从图４．２可以看出，在一定条件下酶促反应的速度与酶浓度成正比。符合基本的米氏方程，且此反应为可逆反应，因而从理论上符合Ｂｒｉｇｇｓ－Ｈａｌｄａｎｃ对米氏方程的修订，即稳态处理法。因为酶进行反应时，首先要与底物形成一中间物，即酶底物复合物。当底物浓度大大超过酶浓度时，反应达到最大速度，如果此时增加酶的浓度，可增加反应速率，酶促反应速率与酶浓度成正比关系。ＯＯＯＯ０∞＼＿艟避Ｏ∞∽｛宝惦舛∞Ｏ０Ｏ００ＯＯ∞＼【Ⅲ埒蹲理堪Ｏ∞昕宝∞∞乏；毗３５４０４５５０５５温度（℃）图４．３温度对反应速率的影响Ｆｉｇ．４－３ＥｆｆｅｃｔｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅＯｎｔｈｅｒｅａｃｔｉｏｎｒａｔｅ从图４．３可以看出，反应温度在４０＂Ｃ时反应速率达到最大值。而第二章我们得出反应温度在３５＂Ｃ时浓缩效果较好，原因是最适温度不是酶的特征物理常数，常受其他条件如底物种类、作用时间、ｐＨ和离子强度等因素影响而改变。最适温度随着酶３６广东海洋大学硕士学位论文促作用时间的长短而改变，由于温度使酶蛋白变性是随时间累加的，反应时间短则最适温度高，因此在反应丌始阶段酶的最适温度是４０。Ｃ，反应后期酶的最适温度是３５℃。４．２．４缓冲溶液ｐＨ对反应速率的影响０．０６０＼名Ｖ吕０５僻蚓０４ｉ／，／～、４５、搓堪０３０．０２６７８９１０缓冲溶液ｐＨ图４－４．缓冲溶液ｐＨ对反应速率的影响Ｆｉｇ４－４ＥｆｆｅｃｔｂｕｆｆｅｒｓｏｌｕｔｉｏｎｐＨｏｎｔｈｅｒｅａｃｔｉｏｎｒａｔｅ由图４－４可以看出缓冲溶液ｐｎ为７时反应速率达到最大值。酶的活力受环境ｐＨ的影响，在环境ｐＨ为７时酶表现出最大活力。当ｐＨ改变不很剧烈时，酶虽未变性，但活力受到影响。ｐＨ影响了底物的解离状态；或者使底物不能和酶结合，或者结合后不能生成产物：ｐＨ影响酶分子活性部位上有关基团的解离，从而影响与底物的结合或催化，使酶活性降低；也可能影响到中间络合物ＥＳ的解离状态，不利于催化生成产物。４．２．５反应动力学参数的求解岛．是酶的一个特性常数，‰的大小只与酶的性质有关，而与酶浓度无关，故对某一酶促反应而言，在一定条件下都有特定的‰．值，可用来鉴别酶。‰值可以判断酶的专一性和天然底物，有的酶可作用于几种底物，因此就有几个‰值，其中‰值最小的底物称为该酶的最适底物也就是天然底物。试验所得数据见表４．１，对其按照Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ－Ｂｕｒｋ双倒数作图见图４．５，得回归直线方程为：ｙ＝３．００１ｘ＋６．６０２胆０．８０４５由１：娄坠×去＋０一ｙ二【ｓ】‰。Ｖ，可得１／Ｖｍａｘ＝６．６０２，Ｋｍ／Ｖｍ。＝３．００１，因此可求得Ｖｍａｘ＝０．１５ｍｏｌ／Ｓ，Ｋｍ＝ｏ．４５ｍｏｌ／Ｌ脂肪酶水解鱼油富集ＤＨＡ、ＥＰＡ甘油酯的研究表４．１反应底物浓度的倒数和反应速度的倒数Ｔａｂｌｅ４－１ｒｅａｃｔｉｖｅｓｕｂｓｔｒａｔｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｒｅｃｉｐｒｏｃａｌａｎｄｒｅａｃｔｉｏｎｒａｔｅｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ１／Ｖ１５．３４１３．８２１６．１３２０．９７１／ＩＳ］２６．７７３０２５２０‘ｘ≥㈠５０１二２３４５１／［明图４－５反应底物浓度的倒数对反应速度的倒数图Ｆｉｇ４－５ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌｇｒａｐｈｏｆｒｅａｃｔｉｖｅｓｕｂｓｔｒａｔｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｒｅｃｉｐｒｏｃａｌａｎｄｒｅａｃｔｉｏｎｒａｔｅｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ４．３本章小结本章以酶促反应动力学为基础讨论了底物浓度、酶浓度、缓冲溶液ｐＨ、反应温度等因素对酶促反应速率的影响。通过试验，获得了该酶促鱼油水解反应的动力学参数：米氏常数Ｋｍ＝０．４５ｍｏｌ／Ｌ，最大反应速度‰。ｘ－Ｏ．１５ｍｏｌ／Ｓ，相应的米氏方程为：矿：竺：！型１０．４５＋【吲研究结果表明在动力学控制条件下，脂肪酶ＯＦ催化鱼油水解的反应符合Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ．Ｍｅｎｔｅｎ单底物酶促反应动力学理论。广东海洋大学硕士学位论文第五章ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯的热稳定性和氧化动力学热分析是广泛应用于油脂的一种分析技术，在所有的热分析方法中，差示扫描量热法（ＤＳＣ）是应用比较多的一种方法。ＤＳＣ法是指在程序控温下，测量输给待测物质与参比物的功率差与温度（或时间）的关系。它可以用于测定油脂的单变性多晶型，油脂的氢化程度，油脂酯交换反应前后物性的改变以及油脂掺伪的鉴定，还可以测定油脂的比热容和油脂的固体脂肪指数（ＳＦＩ）等等，近儿年来，对ＤＳＣ法在油脂领域的应用研究不断发展，目前已成功应用于检测油脂在深度煎炸和加热过程中的氧化，测定油脂的氧化稳定性以及油脂的氧化动力学和抗抗氧化剂在油脂中的抗氧化活性等等【７０】。油脂的热稳定性和氧化稳定性是其加工、贮藏和消费的重要指标之一，本章利用ＤＳＣ法研究了ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯在空气气氛下的热氧化反应，求出了热氧化反应的动力学参数，为甘油酯的加工、贮藏、和消费过程提供基础性数据。５．１材料与方法５．１．１试验材料ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯（按第二章工艺参数制取）５．１．２试验方法试验在ＮＥＴＺＳＣＨＳＴＡ４４９Ｃ热分析仪（德国耐驰仪器制造有限公司生产）上进行，配有计算机数据记录和处理系统。大约５．５ｍｇ样品放入陶瓷（Ａ１２０３）坩埚里，盖上盖子，在气氛为空气的情况下进行热反应，每次的样品量不能相差太大，因为样品量对热分析峰的形状和重现性有明显的影响。测量模式采用样品＋校正，每一升温速率下，都用一空坩埚做参比在相应的扫描温度范围内扫描作为基线。空气流量５０ｍＬ／ｍｉｎ，试验过程中维持恒定。ＤＳＣ分析和ＤＴＧ（微商热重法）分析同时进行。５．２结果与讨论５．２．１ＤＳＣ和ＤＴＧ曲线分析在热分析过程中，样品池的大小对峰的位置没有明显影响，但样品池是否加盖则对峰的位置有一定的影响，这可能是由于反应气的进入和挥发性的降解产物的排出的不平衡所造成的。在ＤＳＣ热分析中，峰值温度和峰的形状主要取决于升温速率。峰脂肪酶水解鱼油富集ＤＨＡ、ＥＰＡ甘油酯的研究的相对强度随着升温速率的增加而增加，蜂的位置随着升温速率的增加向高温方向移动。升温速率也会影响峰的尖锐性。高的升滠速率，峰的位置就偏向高温方向，这主要是由于油是热的不良导体的原因，在高的升温速率下，热量从样品池的加热装置传到样品的时问被延长。随着升温速率的变化，ＤＳＣ曲线的变化是很复杂的，有的ＤＳＣ曲线有很多个峰，有的只有一个峰，造成这种现象的主要原因主要是甘油三酯中的脂肪酸的分布特征的不同。一般来说，高度饱和的甘油三酯（由三种饱和脂肪酸组成的酰基甘油）的峰值温度要比高度不饱和的甘油三酯（由三种高度不饱和脂肪酸组成的酰基甘油）的高，其它组成的甘油三酯的峰值温度在上述两种类型之间。对于ＤＳＣ峰的分析可以初步决定油脂的相对组成复杂程度。峰越尖锐，峰的温度范围越窄，浇明甘油三酯中的脂肪酸组成具有高度的协调性（ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅｎａｔｕｒｅ）。在ＤＳＣ的加热过程中，复杂的甘油三酯氧化热反应可能同时发生，因此在某一温度范围内，两种或两种以上的甘油三酯可能同时发生氧化反应，造成温度范围的变宽或重叠。当油样被加热时，热稳定性差的甘油三酯先发生氧化反应，热稳定性好的甘油三酯在高温时发生氧化反应【７ｌ】。畸叫侣幅¨佗们ｏｏ４：ｏ温度，℃图５－１不同升温速翠下的ＤＳＣ曲线Ｆｉｇ５－１ＤＳＣＣＵＩ＇ＶｅｏｆｖａｒｉｏｕｓｒａｔｅｏｆｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｒｉｓｅＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯在不同升温速率下的ＤＳＣ分析见图５－１，从中可以看出，每一升温速率下的ＤＳＣ曲线的基本趋势是一致的，但是升温速率越高，峰的相对强度就越高，峰的位置也向高温方向偏移，热氧化反应发生在比较宽的温度范围内，说明ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯的组成比较复杂，有较宽的分子质量分布。ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯的ＤＳＣ曲线在达到最大峰值温度以前，曲线比较弯曲，有一个小峰出现，造成这种现象的原因可能是ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯的脂肪酸组成比较复杂。利用气相色谱对ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯的脂肪酸组成迸行分析，发现ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯中的脂肪酸种类比较多，而且有一定量的饱和脂肪酸，与ＤＳＣ曲线分析结果相～致。４０广东海洋大学硕士学位论文对ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯同时进行了ＤＴＧ（微商热重法）分析，结果见图５．２。从图５．２中可以看出，随着热氧化反应的进行，形成的过氧化物的分解速率快速增加，产生一些挥发性的化合物，随着气流被带走，质量开始逐渐减少；到达氧化反应的最后阶段，一些氧化产物会发生聚合反应，产生高分子量的产物和低分子量的羰基及羟基化合物，所以在图中的曲线表现为曲线不回到零点。从图５．２中还可以看出，甘油酯的热氧化降解过程主要发生在３００℃－－５００℃阶段。ＤＴＧ／（％／ｒａｉｎ）１００２００３００４００温度ｍ一升韫远军５。Ｃ／ｍｉｎ…一升温速单１５。Ｏ／ｍｉｎ…一升温速宰２０。Ｃ／ｍ血……升楹逯军１０。Ｃ／ｍＪ．ｎ图５－２不同升温速率下的ＤＴＧ曲线Ｆｉｇ５－２ＤＴＧｃｔｌｒｖｅｏｆｖａｒｉｏｕｓｒａｔｅｏｆｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｒｉｓｅ５．２．２热分析动力学理论【７２－７４］化学反应的热分析动力学方程如下：ｒ＝ｄａ／ｄｔ＝ｋ（７３ｆｉａ）……一一……ｑ）贝ａ）：反应模型；ａｔ反应程度；颤Ｄ：速率常数；ｆ：时间；ｒ：反应速率“玲利Ｐ咧册一………………②Ｅ：活化能，ｋＪ／ｍｏｌ；Ａ：指前因子；Ｒ：气体常数，其值为８．３１４Ｊ／（Ｋ·ｍ０１）；ｎ绝对温度，Ｋ。转换决定函数苁ａ），是比较复杂的，仅在有限的试验条件范围内有效。假定反应是一个简单的胛级反应，函数Ａａ）可表示为：瓜ａ）＝（１—以产阡＿～一…一…一③胍剩余的质量百分比；玎：反应级数。一般的热动力学分析都是基于上述３个基本的方程。可以对单一升温速率的热动力学进行分析，也可对多个升温速率的热动力学进行分析等等。脂肪酶水解鱼油富集ＤＨＡ、ＥＰＡ甘油酯的研究对方程①进行积分得：Ｈａ刊矿血／他）＝对ｏ『ｄｆ－＿－…～～一一④升温速率口的方程为：＃＝ｄＴ／ｄｔ－……一…一一～…．⑤经过上述方程的代换，方程④变为：足ｎ爿ｏａｄａ／Ｊ（ａ）＝（Ａ／Ｂ）船’础朋ｄ卜……⑥试验是在大量的空气条件下进行的，氧浓度是固定的，氧化过程中的氧的消耗量可以不计，这就意味着在这种条件下，反应速率是不依赖于氧浓度的，只要氧化起始速率是常数，反应就可被认为是一级反应。氧化反应的起始：ＲＨ—Ｒ。，Ｒ’＋０２＂－－Ｒ０２＋（【Ｒ‘］“【Ｒ０２’】）。（１）ＦｌｙｎｎａｎｄＷａｌｌａｎｄＯｚａｗａ对方程⑥进行处理得到下面的方程：ｌｏｇ萨·０．４５６７Ｅ／（ＲＤ＋常数……～一一⑦从方程⑦可以看出，】ｏ酗与１／Ｔ成线性关系，以ｌｏ够对１／Ｔ作图得到一直线，通过直线的斜率可求出活化能Ｅ。（２）Ｋｉｓｓｉｎｇｅｒ得到如下方程：ｌｏｇ（Ｂ／ｒ）一０．４３４３Ｅ／（ＲＴ）＋常数～…一⑥从方程⑧可以看出，ｌｏｇ拶而与１／Ｔ成线性关系，以ｌｏｇ够／吩对ｌ仃作图得到一直线，通过直线的斜率可求出活化能五。５．２．３ＤＳＣ热氧化动力学对于不同升温速率的ＤＳＣ曲线，在最大反应速率（即峰顶温度乃）处，样品的转化率基本相同［７５，７６１。（１）Ｆｌｙｎｎ—Ｗａｌｌ．Ｏｚａｗａ法动力学参数分析利用Ｆｌｙｎｎ—Ｗａｌｌ．Ｏｚａｗａ方程对ＤＳＣ曲线的动力学进行分析，从图５．１中得到各项动力学参数见表５－Ｉ。分别以Ｉｏ妒对Ｉ／Ｔ作图，见图５．３。表５－１Ｆｌｙｒｍ－Ｗａｌｌ－Ｏｚａｗａ法动力学参数Ｔａｂｌｅ５－１ＫｉｎｅｔｉｃｐａｒａｍｅｔｅｒｓｏｆＦｌｙｒｍ－Ｗａｌｌ－Ｏｚａｗａｅｑｕａｔｉｏｎ甘油酯的ｌｏ：与１／％的线性关系方程为ｙ＝－１５．２５７ｘ＋１９．０１，相关系数（舻）为０．９９７，直线具有较高的相关系数。计算求得其它动力学参数见表５．２。活化能Ｅ的大广东海洋大学硕士学位论文小反映了反应速率随温度的变化程度。活化能较大的反应，温度对反应速率影响较显著，升高温度能够显著加快反应速率，活化能较小的反应则反之。表５－２Ｆｌｙｎｎ．Ｗａｌｌ．Ｏｚａｗａ动力学参数计算值Ｔａｂｌｅ５－２ＫｉｎｅｔｉｃｐａｒａｍｅｔｅｒｓｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｖａｌｕｅｓｏｆＦｌｙｎｎ－Ｗａｌｌ－Ｏｚａｗａｅｑｕａｔｉｏｎ升温速率卢（℃／ｍｉｎ）５１０１５２０活化能毋ｋＪ／ｍ０１）２７７．７５２７７．７５２７７．７５２７７．７５峰值温度Ｅ／（ＲＤ瓦（Ｋ）８３６．３８４５，８８５４．６８６５．７３９．９５３９．５０３９．０９３８．５９０．２４０．４７０．６９０．８９ｋ（ｍｉｎ“）ｌｎＡ３８．５１３８．７４３８．７ｌ３８．４８ｈａ（ｍｉｎ）２．９０１．４８ｌ－０ｌ０．７８１．４１９．０１１．２吨匕０１三０．８０．６０．４１．１５１．１６１．１７１．１８１＿１９１．２１．２１１／Ｔｐ（×１０３）图５－３峰值温度与升温速率的关系Ｆｉｇ５－３Ｒｅｌａｔｉｏｎｏｆｐｅａｋｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅａｎｄｒａｔｅｏｆｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｒｉｓｅ（２）Ｋｉｓｓｉｇｅｒ法动力学参数分析利用Ｋｉｓｓｉｇｅｒ方程对ＤＳＣ曲线的动力学进行分析，从图５—１中得到动力学参数见表５．３。分别以ｌｏｇ（ｆｌ／Ｔｅ）对ｌ仃作图，见图５－４。ＤＨＡ、ＥＰＡ甘油酯的ｌｏｇ∥，）与１／Ｔｐ的线性关系方程为Ｊ，＝．１４．６８６ｘ＋１２．４７７，相关系数（Ｒ２）为０．９９７９。直线具有较高的相关系数。计算求得其它动力学参数见表５－４。表５－３Ｋｉｓｓｉｇｅｒ法动力学参数Ｔａｂｌｅ５－３ＫｉｎｅｔｉｃｐａｒａｍｅｔｅｒｓｏｆＫｉｓｓｉｇｅｒｅｑｕａｔｉｏｎ脂肪酶水解鱼油富集ＤＨＡ、ＥＰＡ甘油酯的研究，＝一１４．６８６ｘ＋１２．４７７一４·４』酽＝０．９９７９￡：『善一ｓ“：瓢１．１６Ｊ．一——Ｊ．．．．。．．．．１ｊ…－１．１６Ｌ１７１．１８１．１９１．２１．２１图５。４峰值温度与升温速率的关系Ｆｉ９５－４Ｒｅｌａｔｉｏｎｏｆｐｅａｋｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅａｎｄｒａｔｅｏｆｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｒｉｓｅ表５－４Ｋｉｓｓｉｇｅｒ动力学参数计算值Ｔａｂｌｅ５－４ＫｉｎｅｔｉｃｐａｒａｍｅｔｅｒｓｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｖａｌｕｅｓｏｆＫｉｓｓｉｇｅｒｅｑｕａｔｉｏｎ升温速率卢活化能峰值温度龇ＲＤｋ（ｍｉｎ－１）１州“月（ｍｉｎ）！！塑虫！里！！塑！生墨！坠５２８１．１４８３６．３４０．４３０．２４３９．０１２．８７１０勰４蚪５８扣％Ｏ卯”∞ｌ盯１５勰４：２４６的卯Ｏ毋强∞１∞２０勰４％５７盼嘶Ｏ帅强％０＂从表５－４中同样可以得到Ｆｌｙｒｍ．Ｗａｌｌ．Ｏｚａｗａ法一样的结论。对表５—２和表５－４中的活化能数据比较可知，Ｋｉｓｓｉｇｅｒ法计算得到活化能稍大于Ｆｌｙｒｍ—Ｗａｌｌ—Ｏｚａｗａ法，其它动力学参数值也都基本接近，误差在热动力学分析允许的范围内。蜕明这两种热动力学分析计算方法具有一致性。５．３本章小结通过对ＤＳＣ曲线的分析表明，ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯组成复杂，脂肪酸种类比较多，有较宽的分子量分布。分别用Ｆｌｙｎｎ—Ｗａｌｌ．Ｏｚａｗａ法和Ｋｉｓｓｉｎｇｅｒ法计算了鱼油的热氧化反应动力学参数，两种计算方法得到的动力学参数具有一致性，对鱼油的加工、贮藏、和消费具有一定的指导意义。广东海洋大学硕士学位论文第六章总结论天然鱼油中ＤＨＡ和ＥＰＡ相对含量比较低，直接食用或者添加到其它食品中保健和医疗效果比较差。为了增强ＤＨＡ和ＥＰＡ的生理活性，就必须提高产品中的ＤＨＡ和ＥＰＡ的含量。ＤＨＡ和ＥＰＡ作为医药和保健品最佳的存在形式为甘油酯形式。脂肪酶催化鱼油选择性水解法是富集高含量ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯的一种有效方法。通过对该课题系统而深入的研究，主要得出以下结论：（１）对脂肪酶催化鱼油水解工艺参数的研究。在单因素的基础上采用响应面试验设计对工艺参数进行了优化，经ＳＡＳ多元统计分析，获得了脂肪酶ＯＦ催化水解鱼油富集ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯的一个关于响应变量（ＤＨＡ和ＥＰＡ的总含量Ｙ）随决定变量（油水比例Ｘｌ，缓冲溶液ｐＨＸ２，酶浓度ｘ３，温度Ｘ４）变化的数学模型。Ｙ＝一１５１．７８＋５２．８４盖２＋２．００Ｘ４—３．９４Ｘ；一０．０３Ｘ；该模型的决定系数Ｒ２＝ｏ．８６，回归方程呈极显著，失拟项不显著，这都充分说明模型与实际情况拟台较好。综合考虑，获得酶促水解的最佳工艺参数为：油水比为１：４、缓冲溶液ｐＨ值６．５，酶浓度２０ｍｇ／ｇ油，反应温度为３５。Ｃ的情况下水解２４ｈ，在该反应条件下ＤＨＡ和ＥＰＡ总含量的模型预测值为６０．０５％，而实际获得产物中ＤＨＡ和ＥＰＡ总含量达６１．４８％，其中ＤＨＡ含量为５６．２２％，ＥＰＡ含量为５．２６％，模型预测值与实际值的误差仅为２％。由于影响因素的复杂性，该数学模型的准确性还需要进一步的论证。（２）脂肪酶催化水解得到的ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯的理化性质均达到了我国水产行业标准规定的鱼油一级标准，充氮气保护能有效的防止多不饱和脂肪酸的氧化。ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯的脂肪酸组成特点为：饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸含量较低，ｃ１４０，ｃ１６０和Ｃ１８０含量分别为１．０４％、７．４０％、１．３９％，Ｃ１６：１和Ｃｉｓ：Ｉ含量分别为３．０１％、１１．６９０，４，主要以多不饱和脂肪酸为主，总含量为７０．６３％，其中ＤＨＡ和ＥＰＡ的含量分别为５６．２２％和５．２６％。ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯经硅胶柱层析分离并利用傅立叶近红外光谱鉴定，结果表明：ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯中的组分主要以甘油二酯为主，含量为６４．３２％：其次是甘油三酯和甘油一酯，含量分别为３５．２３％和Ｏ．４５％。通过对黄鳍金枪鱼鱼油和ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯的脂肪酸组成进行分析比较可以推断，脂肪酶ＯＦ对鱼油中脂肪酸的水解可能具有一定的选择性，一些饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸如Ｃ１４ｏ、Ｃ１６ｌｏ、Ｃ１８，ｌ容易被水解，对ＤＨＡ的富集效果好与对ＥＰＡ的富集效果，这可能是由于脂肪酶ＯＦ对脂肪酸的水解具有一定的选择性，脂肪酸的链越长、双键越多就越难被脂肪酶ＯＦ水解掉，从而被富集在甘油酯中。４５脂肪酶水解鱼油富集ＤＨＡ、ＥＰＡ甘油酯的研究（３）以对酶促反应为基础研究发现脂肪酶催化鱼油水解反应符合单底物酶促反应动力学理论。根据试验获得了脂肪酶催化鱼油水解反应的米氏方程：矿：！：！墅ｊ。Ｏ．４５＋ｆｓ】（４）由于ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯中多不饱和脂肪酸含量比较高，容易发生氧化，影响产品的质量。采用差示扫描量热（ＤＳＣ）法和微商热重（ＤＴＧ）法对ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯进行了分析。ＤＳＣ的分析表明，ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯的热稳定性和氧化过程都与甘油酯组成及脂肪酸组成密切相关；ＤＴＧ的分析表明，ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯的热氧化过程发生在３００．５００℃阶段。利用Ｆｌｙｎｎ．Ｗａｌｌ，Ｏｚａｗａ法和Ｋｉｓｓｉｇｅｒ法分别计算出了ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯的热氧化动力学参数，两种方法具有一致性。为预测ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯产品的货架期提供了可靠的理论依据。本论文创新点主要体现在以下三个方面：（１）关于脂肪酶水解鱼油富集ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯的研究，国内外都已有报道，一般ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯中ＤＨＡ和ＥＰＡ总含量在５０％左右，ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯中ＤＨＡ和ＥＰＡ总含量与原料鱼油中ＤＨＡ和ＥＰＡ总含量有着直接的关系。本研究在查阅了大量外文文献的基础上，选择了脂肪酶ＯＦ对黄鳍金枪鱼鱼油进行水解，有效的富集了ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯，确定了酶法水解的较佳工艺参数。在该条件下甘油酯中ＤＨＡ、ＥＰＡ的含量分别由２２．０６％和４．８１％提高到为５６．２２％和５．２６％，ＤＨＡ和ＥＰＡ总含量达到了６１．４８％。（２）目前关于脂肪酶催化鱼油水解富集ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯的研究主要集中在工艺参数方面，对其反应动力学研究较少。本研究以酶促反应理论为基础研究了脂肪酶催化鱼油水解的动力学，通过试验获得了酶促反应动力学的米氏方程，为控制反应的进行程度，估算反应进行某种程度所需要的时间等实际应用奠定了理论基础。（３）关于ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯的分析．国内的研究主要为分析其脂肪酸组成，而对ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯组分的分离未见报道。本文通过硅胶柱层析对ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯进行分离，得到甘油一酯、甘油二酯和甘油三酯三个组分，这三个组分经傅立叶变换红外吸收光谱扫描，进一步验证了其组分和分离的效果。广东海洋大学硕士学位论文参考文献ｌＪｅｆｆｒｅｙ，ＢＧ．Ｗｅｉｓｉｎｇｅｒ，ＨＳ．Ｔｈｅｒｏｌｅｏｆｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃａｃｉｄｉｎｒｅｔｉｎａｌｆｕｎｃｔｉｏｎ［Ｊ】．Ｌｉｐｉｄｓ，２００１，３６（９）：８５９－８７ｌ２Ｎｅｕｒｉｎｇｅｒ，Ｍ．Ｉｎｆａｎｔｖｉｓｉｏｎａｎｄｒｅｔｉｎａｌｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｓｔｕｄｉｅｓｏｆｄｉｅｔａｒｙｌｏｎｇ—ｃｈａｉｎｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄｆａｔｔｙａｃｉｄｓ：ｍｅｔｈｏｄｓ，ｒｅｓｕｌｔｓ，ａｎｄｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ［Ｊ】．ＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｕｍａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＮｕｔｒｉｔｉｏｎ，２０００，７ｌ（１）：２５６－２６７３Ｋａｌｍｉｊｎ，Ｓ．Ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄｆａｔｔｙａｃｉｄｓ，ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ，ａｎｄｃｏｇｎｉｔｉｖｅｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｖｅｒｙｏｌｄｍｅｎ［Ｊ】．ＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＥｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，１９９７，１４５（１）：３３—４１４ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｉｈａｏｌａ．ｃｏｍ／ｉｎｆｏ／ｄｅｔａｉｌ．ａｓｐ？ｉｄ＝３３１１５ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｎｇｑｉａｏｎｅｔ．ｃｏｍ／ｎｅｗｓｐｕｂ／ｙａｎｘｉａｎｎｉ．ｐｈｐ？ｔｉｄ＝２０＆ｉｄ２２３５２＆ｍａｉｎｉｄ＝２３７５６ＢｕｃｈｅｒＨＣ，ＨｅｎｇｓｔｌｅｒＰ，ＳｃｈｉｎｄｌｅｒＣ，ｅｔａｌ，Ｏｍｅｇａ－３ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄｆａｔｔｙａｃｉｄｓｉｎｃｏｒｏｎａｒｙｈｅａｒｔｄｉｓｅａｓｅ：ａｍｅｔａａｎａｌｙｓｉｓｏｆｒａｎｄｏｍｉｚｅｄｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄｔｒｉａｌｓ［Ｊ】．ＴｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ，２００２，１１２（４）：２９８～３０４７ＦｒａｎｋＢＨ，ＷａｌｔｅｒＣ，ＷｉｌｌｅｔＭＤ，ｃｔａ１．Ｆｉｓｈａｎｄｏｍｅｇａ－３ｆａｔｔｙａｃｉｄｉｎｔａｋｅａｎｄｒｉｓｋｏｆｃｏｒｏｎａｒｙｈｅａｒｔｄｉｓｅａｓｅｉｎｗｏｍｅｎ【Ｊ】．ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＭｅｄｉｃａｌＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，２００２．２８７：１８１５－１８２１８吴克刚，柴向华，杨连生．ｎ．３系多不饱和脂肪酸防治心血管疾病的研究进展［Ｊ］．食品研究与开发，２０００，２１（６）：６～９９万瑞香，隋忠国，陈德利，等．鱼油多烯脂酸对血小板聚集和抗凝血作用的实验研究［Ｊ］．中国海洋药物，２００１，８２（４）：２４～２５１０ＤａｓＵＮ，ＦａｍｓＭＤ．Ｅｓｔｒｏｇｅｎ，ｓｔａｔｉｎｓ，ａｎｄｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄｆａｔｔｙａｃｉｄｓ：ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓｉｎｔｈｅｉｒａｃｔｉｏｎｓａｎｄｄｅｎｅｆｉｔｓｉｓｔｈｅｒｅａｃｏｍｍｏｎｌｉｎｋ？【Ｊ】．Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，２００２，１８：１７８－１８８１１ＮｏｒｄｏｙＡ，ＢｏｎａａＫＨ，ＳａｎｄｓｅｔＰＭ，ｅｔａ１．Ｅｆｆｅｃｔｏｆｏｍｅｇａ－３ｆａｔｔｙＡｃｉｄｓａｎｄｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎｏｎｔｈｅｈｅｍｏｓｔａｔｉｃｒｉｓｋｆａｃｔｏｒｓａｎｄｐｏｓｔｐｒａｎｄｉａｌｈｙｐｅｒｌｉｐｅｍｉａｉｎｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｃｏｍｂｉｎｅｄｈｙｐｅｒｌｉｐｅｍｉａ［Ｊ１．ＡｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓＴｈｒｏｍｂｏｓｉｓＶａｓｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，２０００，２０：２５９－２６５１２ＨｅｌｅｎＭＲ．ＭｉｃｈａｅｌＪＧＥｆｆｅｃｔｏｆｌｏｎｇｃｈａｉｎｎ－３ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄｆａｔｔｙａｃｉｄｓｏｎｆａｓｔｉｎｇａｎｄｐｏｓｔｐｒａｎｄｉａｌｔｒｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．ＴｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＮｕｔｒｉｔｉｏｎ，２０００，７１（ｓｕｐｐｌ）：２３２Ｓ～２３７Ｓ１３ＡｎｇｅｒｅｒＰ，ＶｏｎＳｃｈａｃｋｙＣ．ｎ－３ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄｆａｔｔｙａｃｉｄｓａｎｄｔｈｅｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒｓｙｓｔｅｍ【Ｊ】．ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＬｉｐｉｄｏｌｏｇｙ，２０００，１１：５７～６３１４ＹａｍａｄａＴ，ＳｔｒｏｎｇＪＰ，ＩｓｈｉｉＴ＇ｅｔａ１．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｍｓｉｓａｎｄｏｍｅｇａ－３ｆａｔｔｙａｃｉｄｓｉｎｔｈｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｏｆａｆｉｓｈｉｎｇｖｉｌｌａｇｅａｎｄａｆａｒｍｉｎｇｖｉｌｌａｇｅｉｎＪａｐａｎ［Ｊ］．Ａｔｈｅｒｏｓｃｔｅｒｏｓｉｓ，２０００，４７脂肪酶水解鱼油富集ＤＨＡ、ＥＰＡ甘油酯的研究！＝Ｅ■■■■｜Ｅ！一Ｉ｜１●＝＝！目Ｅ＝＿■■＿＝！Ｅ＝｜自●■Ｅ目！Ｅ！ｊ■■ｊＥ＝ｊ！！ｊ■●Ｅ＝２ｊＥ自日■■ＥＥ－ｚ！＝自●■Ｅ＝＝＝日＿■●≈Ｅ＝！ｊｊ■■Ｅ，＝＝！＝■■■＝目｜＝自■■■Ｉ１５３：４６９—４８ｌ１５洪衡，项志敏．ｏｍｅｇａ－３脂肪酸对心血管的作用及机制．中华老年医学杂志，２００３，２２（４）：２５４～２５６１６Ａｎｇｅｒｅｒ只ＫｏｔｈｎｙＷ：ＳｔｏｒｋＳ，ｅｌａ１．Ｅｆｆｅｃｔｏｆｄｉｅｔａｒｙｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎｗｉｔｈｏｍｅｇａ－３ｆａｔｒｙａｃｉｄｓｏｎｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓｉｎｃａｒｏｔｉｄａｒｔｅｒｉｅｓ【Ｊ】．ＣａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒＲｅｓｅａｒｃｈ，２００２，５４：１８３－１９０１７ＩｋｕｏＩ．，ＥｉｊｉＳ．，ＨａｒｕｋｏＹ．，ｅｔａ１．ＤｉｇｅｓｔｉｏｎａｎｄｌｙｒｅＩｐｈａｔｉｃｔｒａｎｓｐｏｒｔｏｆｅｉｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃａｎｄｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃａｃｉｄｓｇｉｖｅｎｉｎｔｈｅｆｏｒｍｏｆｔｒｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ，ｆｒｅｅａｃｉｄａｎｄｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒｉｎｒａｔｓ【Ｊ】．ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｐｈ３７ｓｉｔｓａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，１９９５（１２５９）：２９７～３０４１８ＹａｎｇＬＹ，ＫｕｋｓｉｓＡ，Ｍｙｈｅｒ，ｅｔａ１．Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｏｆｍｅｎｈａｄｅｎａｎｄｒａｐｅｓｅｅｄｏｉｌａｎｄｔｈｅｉｒｆａｔｔｙａｃｉｄｍｅｔｈｙｌａｎｄｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒｓｉｎｔｈｅｒａｔｓ【Ｊ】．ＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ，１９８９，６７：１９２１９ＬａｗｓｏｎＬＤ，Ｈｕｇｈｅｓ，ＨｕｍａｎＢＧ．Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎｏｆｆｉｓｈｏｉｌｆａｔｔｙａｃｉｄａｓｔｒｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌｓ，ｆｒｅｅｆａｔｔｙａｃｉｄｏｒｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒｓ【Ｊ】．ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｍｕｒｄｃａｔｉｏｎｓ，１９８８，１５２～３２８２０刘书成．黄鳍金枪鱼鱼头中鱼油的提取及蛳３ＰＵＦＡ甘油酯的酶法合成：【博士学位论文】．北京：中国科学院研究生院，２００５２１ＢｏｔｔｉｎｏＮＲ，ＶａｎｄｅｎｂｕｒｇＧＡ，ＲｅｉｓｅｒＲ．Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆｃｅｒｔａｉｎｌｏｎｇ·ｃｈａｉｎｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄｆａｔｔｙａｃｉｄｏｆｍａｒｉｎｅｏｉｌｔｏｐａｎｃｒｅａｔｉｃｌｉｐａｓｅｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ［Ｊ】．Ｌｉｐｉｄ，１９６７，２：４８９２２ＷａｎａｓｕｎｄａｒａＵＮ，ＳｈａｈｉｄｉＦ，Ｌｉｐａｓｅ－－ａｓｓｉｓｔｅｄｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｎ－３ＰＵＦＡｉｎａｃｙｌｇｌｙｅｅｒｏｌｓｆｒｏｍｍａｒｉｎｅｏｉｌｓ【Ｊ】．ＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎｏｉｌＣｈｅｍｉｓｔｓ’ｓｏｃｉｅｔｙ，１９９８，７５：９４５￣９５７２３ＴａｎａｋａＹ，ＦｔｍａｄａＴ，ＨｉｒａｎｏＪ，ｅｔａ１．Ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｏｆｃａｎｄｉｄａｃｙｌｉｎｄｒａｅｅａｌｉｐａｓｅ：ｅｆｆｅｃｔｏｆＤＨＡｏｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｔｏｌｉｐａｓｅ［Ｊ１．ＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎｏｉｌＣｈｅｍｉｓｔｓ’ｓｏｃｉｅｔｙ，１９９３．７０：１０３１～１０３４２４ＴａｎａｋａＹ，ＦａｎａｄａＴ，ＨｉｒａｎｏＪ．ＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＤＨＡｉｎｇｌｙｃｅｒｉｄｅｂｙｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｏｆｆｉｓｈｏｉｌｗｉｔｈｃａｎｄｉｄａｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａｌｉｐａｓｅ【Ｊ】。ＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎｏｉｌＣｈｅｍｉｓｔｓ’ｓｏｃｉｅｔｙ，１９９２．６９：１２ｌ叽１２１４２５ＳｈｉｍａｄａＹ，Ｓｕ幽ａｒａＡ，ＹｅｄｏｎｏＳ，ｅｔａ１．ＥｎｒｉｃｈｍｅｎｔｏｆｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄｆａｔｔｙａｃｉｄｓｗｉｔｈＧｅｏｔｒｉｃｈｕｍｃａｎｄｉｄｕｍｌｉｐａｓｅ册．ＪｏｕｒｎａｌｏｆｌｈｅＡｍｅｒｉｃａｎｏｉｌＣｈｅｍｉｓｔｓ’ｓｏｃｉｅｔｙ，１９９４，７１：９５ｌ￣９５５２６ＳｈｉｍａｄａＹ，ＳｕｇｉｈａｒａＡＹｏｄｏｎｏｓ’ｅｔａ１．ＥｎｒｉｅｈｍａｎｔｏｆｅｔｈｙｌＤＨＡｂｙｓｅｌｅｃｔｉｖｅａｌｃｏｂｏｌｙｓｉｓｗｉｔｈｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄＲｈｉｚＤｐｔｔｓｄｅｌｅｍａｒｌｉｐａｓｅ阴．ＪｏｕｍａｌｏｆＦｅｒｍｅｎｔＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｌ舀１９９７，８４：４Ｒ广东海洋大学硕士学位论文１３８～１４３２７ＳｈｉｍａｄａＹ，ＳｕｇｉｈａｒａＡ，ＹｏｄｏｎｏＳ，ｅｔａ１．ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＤＨＡｂｙｓｅｌｅｃｔｉｖｅｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｆａｔｔｙａｃｉｄｆｒｏｍｔｕｎａｏｉｌｗｉｔｈＲｈｉｚｏｐｕｓｄｅｌｅｍａｒｌｉｐａｓｅ【Ｊ］ＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎｏｉｌＣｈｅｍｉｓｔｓ’ｓｏｃｉｅｔｙ，１９９７，７４：９７－１０１２８ＨｕｒＢＫ，ＷｏｏＤＪ，ＣｈｏｎｇＢ．ＨｙｄｒｏｌｙｓｉｓｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｆｉｓｈｏｉｌｂｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９９，９ｌｉｐａｓｅ·１００Ｔ［Ｊ】．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ２９ＳｈｉｍａｄａＹ，ＳｕｇｉｈａｒａＡ，ＹｏｄｏｎｏＳ，ｅｔａ１．ＥｎｒｉｃｈｍｅｎｔｏｆｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄｆａｔｔｙａｃｉｄｓｗｉｔｈＧｅｏｔｒｉｃｈｕｍｃａｎｄｉｄｕｍｌｉｐａｓｅ阴．ＪｏｕｍａｌｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎｏｉｌＣｈｅｍｉｓｔｓ’ｓｏｃｉｅｔｙ，１９９４，７１：９５１～９５５３０ＳｈｉｍａｄａＹ，ＳｕｇｉｈａｒａＡ，ＹｏｄｏｎｏＳ，ｅｔａ１．ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＤＨＡｂｙｓｅｌｅｃｔｉｖｅｏｆｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｆａｔｔｙａｃｉｄｆｒｏｍｔｕｎａｏｉｌｗｉｔｈＲｈｉｚｏｐｕｓｄｅｌｅｍａｒｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎｏｉｌＣｈｅｍｉｓｔｓ’ｓｏｃｉｅｔｙ，１９９７，７４：９７－１０１３１Ｓｕｎｌｉｐａｓｅ【Ｊ】．ＪｏｕｒｎａｌＴ’ＰｉｇｏｔｔＧＭ，ＨｅｒｗｉｇＲＰ．Ｌｉｐａｓｅ－ＡｓｓｉｓｔｅｄＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｎ－３ＰｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄｓａｌａｒＦａｔｔｙＡｃｉｄｓｆｒｏｍＶｉｓｃｅｒａｏｆＦａｎｎｅｄＡｔｌａｎｔｉｃＳａｌｍｏｎ（ＳａｌｍｏＬ．）．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＦｏｏｄＳｃｉｅｎｃｅ，２００２，６７（ｔ）：１３０—１３６３２ＯｋａｄａＴＩＭｏｒｒｉｓｓｅｙＭＴ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｏｍｅｇａ－３ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄｆａｔｔｙａｃｉｄｓｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｆｒｏｍｓａｒｄｉｎｅｏｉｌｂｙｌｉｐａｓｅ—ｃａｔａｌｙｚｅｄｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ．２００４Ｉｎｓｔｉｔｕｅｏｆｆｏｏｄ１２—１６ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｓｔｓ（ＩＦＴ）ＡｎｎｕａｌＭｅｅｔｉｎｇ，Ｊｕｌｙ３３Ｋｏ，ＷＣ，ＷａｎｇＨＪ，ＨｗａｎｇａＪＳ，ｅｔａ１．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｏｆｔｕｎａｏｉｌｂｙａｓｕｒｆａｃｔａｎｔ－ｃｏａｔｅｄｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００６ｌｉｐａｓｅｉｎｔｗｏｐｈａｓｅｓｙｓｔｅｍ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｆｏｏｄ３４石红旗，缪锦来，李光友，等．脂肪酶催化水解法浓缩鱼油ＤＨＡ甘油酯的研究【Ｊ】．中国海洋药物，２００１，４：１５￣２１３５吴可克．酶促鱼油选择性水解制备ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯的研究川．中国油脂，２００２，２７（３）：９１－９３３６吴可克，俞军，李宗实．酶促鱼油部分水解反应器的选择及探讨．中国油脂，２００５，２５（６）：２１２～２１５３７王运吉，张苓花，张传明．固定化胞内脂肪酶选择性水解鱼油．食品工业科技，２００３，２４（１）：３０～３３３８郑毅，郑楠，卓进峰．利用脂肪酶提高鱼油中多不饱和脂肪酸（ＰＵＦＡＳ）甘油酯．应用于环境生物学报，２００５，１１（５）：５７１～５７４３９ＨａｒａｌｄｓｓｏｎＧ，ＫｒｉｓｔｉｎｓｓｏｎＢ，ＳｉｇｕｒｄａｒｄｏｔｔｉｒＲ，ｅｔＥＰＡａｎｄＤＨＡｂｙｌｉｐａｓｅａ１．ｎｅｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｓｏｆｅｔｈａｎｏｌ【Ｊ】．ｃａｔａｌｙｚｅｄｔｒａｎｓｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｆｉｓｈｏｎｗｉｔｈＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅ４０ＡｍｅｒｉｃａｎｏｉｌＣｈｅｍｉｓｔｓ’ｓｏｃｉｅｔｙ，１９９７，７４：１４１９—１４２３ｔｒｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌｓｂｙｌｉｐａｓｅ－ｃａｔａｌｙｚｅｄＸｕＸｕｅｂｉｎｇ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｓｐｅｃｉｆｉｃ—ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ４９脂肪酶水解鱼油富集ＤＨＡ、ＥＰＡ甘油酯的研究ｒｅａｃｔｉｏｎｓ：ａ２８７－３０３４１ＴａｋａｓｈｉＴ，ＳｅｔｓｕｋｏＨ，ＹｏｉｃｈｒｏｉＴ．Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄｔｒｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌｓｖｉａｔｒａｎｓｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｃａｔａｌｙｚｅｄｂｙｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄｒｅｖｉｅｗ【Ｊ】．ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＬｉｐｉｄｓＳｃｉｅｎｃｅａｎｄｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０００：ｌｉｐａｓｅ【Ｊ】Ｙｕｋａｇａｋｕ，１９９３，４２：３０～３５４２ＹａｍａｎｅＴ，ＳｕｚｕｌｓｉＴ，ＳａｈａｓｈｉＹ，ｅｔａ１．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｎ·３ＰＵＦＡｅｎｒｉｃｈｅｄｆｉｓｈｏｉｌｂｙｌｉｐａｓｅ－ｃａｔａｌｙｚｅｄａｃｉｄｏｌｙｓｉｓｗｉｔｈｏｕｔｓｏｌｖｅｎｔ【Ｊ】．ＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎｏｉｌＣｈｅｍｉｓｔｓ’ｓｏｃｉｅｔｙ，１９９２，６９：１１０４－１１０７４３ＹａｍａｎｅＴ，ＳｕｚｕｌｓｉＴ，ＳａｈａｓｈｉＹ，ｅｔａ１．Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｎ－３ＰＵＦＡｃｏｎｔｅｎｔｏｆｆｉｓｈｏｉｌｂｙｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｃｏｎｔｒｏｌｏｆｌｉｐａｓｅ－ｃａｔａｌｙｚｅｄａｃｉｄｏｌｙｓｉｓ【Ｊ】，ＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎｏｉｌＣｈｅｍｉｓｔｓ’ｓｏｃｉｅｔｙ，１９９３，７０：１２８５—１２８７４４ＮｏｚｏｍｉＴ，ＷａｔｍＭ，ＥｉｊｉＮ．ＵｎｓａｔｕｒａｔｅｄｆａｔｔｙａｃｉｄｓｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｓｏｆｉｎｃｒｅａｓｅｄＥＰＡｃｏｎｔｅｎｔ．ＪＰ６０２３４５８９，１９８５４５ＨａｒａｌｄｓｓｏｎＧ，ＫｒｉｓｔｉｎｓｓｕｎＢ，ＳｉｇｕａｄａｒｄｏｔｔｉｒＲ，ｅｔａ１．ＴｈｅｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｓｏｆＥＰＡａｎｄＤＨＡｂｙｌｉｐａｓｅ—ｃａｔａｌｙｚｅｄｔｒａｎｓｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｆｉｓｈｏｉｌｗｉｔｈＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎｏｉｌＣｈｅｍｉｓｔｓ’ｓｏｃｉｅｔｙ，１９９７，７４：１４１９－１４２３４６ｅｔｈａｎｏｌ【Ｊ】．ＷａｔａｎａｂｅＹ．Ｓｔｅｐｗｉｓｅｅｔｈａｎｏｌｙｓｉｓｏｆｔｕｎａｏｉｌｕｓｉｎｇｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄｃａｎｄｉｄａａｎｔａｒｔｉｃａｌｉｐａｓｅ【Ｊ１．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｓｃｉｎｃｅａｎｄ４７ＬｉＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１９９９，８８：６２２－－６２６ｚｕｙｉ．ＷａｒｄＯＰ．Ｌｉｐａｓｅ－ｃａｔａｌｙｚｅｄａｌｃｏｈｏｌｙｓｉｓｔｏｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｔｈｅＰＵＦＡｏｆｃｏｄｌｉｖｅｒｏｉＩ．【Ｊ】ＥｎｚｙｍｅＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９３，１５：６０１－－６０６４８唐青涛，余若黔，宗敏华等．脂肪酶富集ＥＰＡ和ＤＨＡ的研究进展［Ｊ】．华西药学杂志，２００１，１６（４）：２８９—２９２４９Ｙｕｚ，ＰｅｎｇＫ，ＴａｎｇＹ，ｅｔａ１．Ｌｉｐａｓｅ—ｃａｔａｌｙｚｅｄｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｇｌｙｃｅｒｏｌＰＵＦＡｏｆｆｉｓｈＳｃｉｅｎｃｅ，１９９５，１６：３－７ｓｕｒｆａｃｅｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｏｉｉｉｎｏｒｇａｎｉｃ５０Ｌｉｎｄｅｒｓｏｌｖｅｎｔ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＦｏｏｄＭ．，ＫｏｃｈａｎｏｗｓｋｉＮ．，ＦａｎｎｉＪ．，ｅｔａ１．Ｒｅｓｐｏｎｓｅｌｉｐａｓｅ－ｃａｔａｌｙｓｅｄｅｓｔｅｆｉｆｉｅａｔｉｏｎｏｆｇｌｙｃｅｒｏｌａｎｄｎ－３ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄｆａｔｔｙａｃｉｄｓｆｒｏｍｓａｌｌｎｏｎ５１ｏｉｌ啊．ＰｒｏｃｅｓｓＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００５（４０）：２７３－２７９ｐｏｌｙｕｎｓａｔｌ删ｔｅｄｆａｔｔｙａｃｉｄｂｙＹｏｓｈｉｔｓｕｇｕｋ．ＮａｏｋｉＡ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｔｒｉａｃｙｌｇｌｙｅｅｒｏｌｆｒｏｍｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄｌｉｐａｓｅ闭．ＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎｏｉｌＣｈｅｍｉｓｔｓ’ｓｏｃｉｅｔｙ，１９９４，７１（１２）：１３９７０１４０３５２Ｌｉｚ．Ｙ．．ＷａｒｄＯ．Ｐ．Ｌｉｐａｓｅｃａｔａｌｙｚｅｄｅｓｔｅｒｉｆｉｅａｔｉｏｎｏｆｇｌｙｃｅｒｏｌａｎｄｎ－３ｐｏｌｙｍｓａｔｕｍ。ｄｆａｔｔｙａｃｉｄｅｏｎｅｅｎｌｒａｔｅｉｎｏｒｇａｎｉｃｓｏｌｖｅｎｔ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎｏｉｌＣｈｅｍｉｓｔｓ’ｓｏｃｉｅｔｙ，１９９３，７０：７４５矗４８５３ＣｅｒｄａｎＬ．Ｅ．，ＭｅｄｉｎａＡ…ＲＣｒｉｎｌｅｎｅｚＡ…Ｇｅｔａ１．ＳｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｎＪＦＡｅｎｒｉｃｈｅｄｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｓｂｙｌｉｐａｓｅ－ｃａｔａｌｙｚｅｄ１３—，２９ｅｓｔｅｒｉｆｉｅａｔｉｏｎ四．ＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎ甜Ｃｈｅｍｉｓｔｓ’ｓｏｃｉｅｔｙ，１９９８，７５：５ｎ广东海洋大学硕士学位论文５４ＭｅｄｉｎａＡ—ＲＣｅｒｄａｎＬ。Ｅ．，ＧｉｍｅｎｅｚＡ。Ｇ．，ｅｔａｌ。Ｌｉｐａｓｅ—ｃａｔａｌｙｚｅｄｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｆｉｏｎｏｆｇｌｙｃｅｒｏｌａｎｄｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄｆａｔｔｙａｃｉｄｓｆｒｏｍｆｉｓｈａｎｄｍｉｃｒｏａｌｇａｅｏｉｌｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９９，７０：３７９～３９１５５ＨｅＹ．ＳｈａｈｉｄｉＦ．Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｎ－３ｆａｔｔｙａｃｉｄｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｆｒｏｍｓｅａｌｂｌｕｂｂｅｒｏｉｌｗｉｔｈｇｌｙｃｅｒｏｌ【Ｊ】．ＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎｏｉｌＣｈｅｍｉＳｔｓ’ｓｏｃｉｅｔｙ，１９９７，７４：“３３－１１３６５６ＨａｒａｌｄｓｓｏｎＧ，ＧｕｄｍｕｎｄｓｓｏｎＢ，Ａｌｍａｒｓｓｏｎ．ＴｈｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｓｏｆＥＰＡａｎｄＤＨＡｂｙｌｉｐａｓｅ．ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎｌｅＲｅｒｓ，１９９５，５１：９４１—９５２５７ＲｏｓｕＲ，１ｗａｓａｋｉＹ，ＳｈｉｍａｄｚｕＮ，ｅｔａ１．ＥｎｚｙｍａｔｉｃｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｇｌｙｃｅｒｉｄｅｓｆｒｏｍｅｓｔｅｒｂｙｇｌｙｃｅｒｏｌｙｓｉｓｕｎｄｅｒＤＨＡ—ｅｎｒｉｃｈｅｄＰＵＦＡｅｔｈｙｌｖａｃｃｕｍ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌｅＣａｔａｌｙｓｉｓＢ：ｅｎｚｙｍａｔｉｃ，１９９８，４：１９１－１９８５８ＬｉｎｄｅｒＭ．，ＫｏｃｈａｎｏｗｓｋｉＮ．，ＦａｎｎｉＪ．，ｅｔａ１．Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓｕｒｆａｃｅｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｌｉｐａｓｅ－ｃａｔａｌｙｓｅｄｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｇｌｙｃｅｒｏｌａｎｄｎ：３ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄｆａｔｔｙａｃｉｄｓｆｒｏｍｓａｌｍｏｎｏｉｌ［Ｊ１．ＰｒｏｃｅｓｓＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００５（４０）：２７３～２７９５９ＢｏｔｔｉｎｏＮＲ，ＶａｎｄｅｎｂｕｒｇＧＡ，ＲｅｉｓｅｒＲ．Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆｃｅｒｔａｉｎｌｏｎｇ－ｃｈａｉｎｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄｆａｔｔｙａｃｉｄｏｆｍａｒｉｎｅｏｉｌｔｏｐａｎｃｒｅａｔｉｃｌｉｐａｓｅｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ［Ｊ１．Ｌｉｐｉｄ．１９６７．２：４８９～４９４６０牟峻，曲忠文．鱼油制品中ＤＨＡ／ＥＰＡ检测方法的研究．食品科学．２００１，２２（１０）：７６～７８６ｌ郑文晖，谭炳炎，汤丽芬等．气相色谱法测定鲜虫中的脂肪酸含量．色谱，１９９６，１４（１）：５３－５４６２袁志发，周静芋编著．试验设计与分析．北京：高等教育出版社，２０００６３刘魁英主编．食品研究与数据分析．北京：中国轻工业出版社，１９９８６４中华人民共和国标准．动物油脂酸价和酸度的测定：ＧＢ／Ｔ６５中华人民共和国标准．油脂过氧化值的测定：ＧＢ／Ｔ６６中华人民共和国标准．皂化值的测定：ＧＢ／Ｔ５５３０－－－１９９８５５３８－－－１９９５５５３４－－－１９９５６７中华人民共和国标准．植物油碘价的测定：ＧＢ／Ｔ５５３２－－１９９５６８苏克曼，潘铁英，张玉兰编著．波谱解析法．上海：华东理工大学出版社，２００２６９王镜岩，朱圣庚，徐长法编著．生物化学．北京：高等教育出版社，２００２７０梁国眉，黄和孝编．ＪＹ，ｒ０１４．ｔ９９６热分析方法通则．北京：科学技术文献出版社，１９９７７１ＴａｎＣ只ＣｈｅｎＭａｎＹＢ。Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｃａｎｎｉｎｇｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙａｎａｌｙｓｉｓｏｆｅｄｉｂｌｅｏｉｌｓ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｔｈｅｒｍａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓａｎｄｃｈｅｍｉｃａｌｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＯｉｌＣｈｅｍｉｓｔｓ’Ｓｏｃｉｅｔｙ，２０００，７７：１４３～１５５Ａｍｅｒｉｃａｎ７２ＯｚａｗａＴＡｎｅｗｍｅｔｈｏｄｏｆａｎａｌｙｓｉｓｔｈｅｒｍｏｇｒａｖｉｍｅｔｒｉｃｄａｔａ．ＢｕｌｌＣｈｅｍＳｏｃ５１Ｊａｐａｎ，脂肪酶水解鱼油富集ＤＨＡ、ＥＰＡ甘油酯的研究１９６５，３８（１１）：１８８１～１８８４７３ＫｉｓｓｉｎｇｅｒＦＨ．Ｒｅａｃｔｉｏｎｋｉｎｅｔｉｃｓｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｈｅｒｍａｌａｎａｌｙｓｉｓ．ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９５７，２９（１１）：１７０２－１７０６７４李余增编著．热分析．北京：清华大学出版社，１９８７７５于伯龄．Ｉ级反应ＤＴＧ、ＤＴＡ与ＤＳＣ曲线峰顶温度关系的研究．北京服装学院学报（自然科学版），２００１，ｌ（２１）：２６－一３０７６王新芳，朱沛华，曹晓冉，孙同山．差示扫描量热法测定食用油脂得热氧化稳定性及氧化寿命．化学分析计量，２００ｔ，１０（４）：１７－１９广东海洋大学硕士学位论文致谢本论文是在导师章超桦教授的悉心指导下完成的。从论文的选题、试验方案的设计与实施到论文的修改与付梓，无处不凝聚着导师的心血。导师富有魅力的人格、渊博的知识、活跃的学术思维、实事求是的严谨作风、孜孜以求的探索精神、对科学问题的深邃敏锐的洞察力、勇于开拓创新和高度敬业的治学态度使我获益匪浅，并将激励和鞭策着我在今后的人生旅途中努力奋斗。论文的完成离不开多位专家教授和老师的全力支持与帮助。感谢洪鹏志副教授、吉宏武副教授、杨萍副教授、曾少葵副教授、郝记明高级实验师、吴晓萍副教授、刘书成博士、曹文红博士、张静老师、孔美兰、常志娟等给予的热情指导和支持：感谢现代生物化学研究中心的杨捷研究员、刘展雄研究员、廖燕和吴育廉老师、热带作物加工研究所分析中心的老师等都在实验仪器的使用上给提供的方便，这都为本论文的完成创造了条件。难以忘怀共同学习的郝更新、邵海艳、张伟伟、杨粲、蒋巧俊、郝志明等同学，我们共同探讨问题，互相帮助，渡过了一段有意义的时光，建立真挚的友谊。感谢师妹谢燕、王学娟，师弟高加龙、蔡本利、于峰给予我实验和生活上的关心和帮助。感谢家人多年来对我的无私奉献，在此向他们表示深深的祝福！最后，向论文评阅和答辩委员会的专家、教授致以最诚挚的谢意！Ｉ！脂肪酶水解鱼油富集ＤＨＡ、ＥＰＡ甘油酯的研究作者简介孙丽萍，女，中共党员，出生于１９７９年１月，山东烟台人。教育经历；１９９９年９月．２００３年６月就读于山东农业大学食品科技学院食品科学与工程专业，获工学学士学位２００３年９月．２００６年６月就读于广东海洋大学食品科技学院水产品加工及贮藏工程专业。发表论文情况：章超桦，孙丽萍，刘书成．脂肪酶水解鱼油富集中ＤＨＡ和ＥＰＡ甘油酯的过程参数优化．中国水产学会第六届青年学术年会论文集，２００５，１２．导师简介本人导师章超桦教授，现任广东海洋大学食品科技学院院长、海洋食品研究所所长，日本东京水产大学博士，中国科学院南海海洋研究所海洋生物专业博士生导师，国务院政府特殊津贴专家，广东省“千百十工程”省级培养对象。主要研究方向为南海海洋生物资源的加工与综合利用、海洋功能性因子和功能性食品的开发应用研究等。主持和已完成了国家教委、省科技厅、省教育厅、省海洋与渔业局等各类科研课题十多项，在国内外权威学术杂志上发表了论文４０多篇，其中ＳＣＩ３篇；参编教材２部；获国家海洋局科技进步三等奖一项（第一完成人），省级教学成果二等奖一项（第一完成人）：申请国家发明专利４项。获广东省南粤教书育入优秀教师（特等奖），广东省农业科技先进工作者、全国优秀教师等荣誉称号。现担任教育部高等学校食品与营养科学教学指导委员会委员，中国水产学会水产品加工与综合利用专业委员会副主任委员；广东省水产学会理事、水产品加工与质量控制专业委员会主任委员；广东省食品学会副理事长、海洋食品专业委员会主任委员等学术团体职务。脂肪酶水解鱼油富集DHA和EPA甘油酯的研究

作者：

学位授予单位：

孙丽萍

广东海洋大学

本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Thesis_Y1005782.aspx