热证大鼠脂肪代谢及解耦联蛋白1mRNA表达的相关研究_黄丽萍

#541#

#实验研究#

热证大鼠脂肪代谢及解耦联蛋白1mRNA表达的相关研究

黄丽萍,彭淑红,蒙晓芳,胡 强,陈凯峰,余日跃,刘红宁,孙建宁

(11北京中医药大学中药学院,北京100102;21江西中医学院,江西南昌330004;

31江西中医学院现代中药制剂教育部重点实验室,江西南昌330004)

摘 要:目的:探讨甲状腺素片所致热证大鼠脂肪代谢及解耦联蛋白1(UCP1)mRNA表达。方法:甲状腺素片灌胃大鼠30天,测定¹大鼠的体重和体温;º血脂相关指标;»血清T3、T4、TSH;¼棕色脂肪UCP1mRNA表达水平。结果:与空白组比较,热证大鼠:¹体温升高,体重增加缓慢;º血清TC和LDL-C显著降低,FFA含量以及LDL与HL酶活性显著升高;»FT3和FT4水平显著降低;¼UCP1mRNA的表达显著增加。结论:甲状腺片所致热证动物的能量代谢加快,产热增加。

关键词:甲状腺片;能量代谢;热证模型

中图分类号:R203 文献标识码:A 文章编号:1000-1719(2010)03-0541-03

TheStudyonFatMetabolismandUncouplingProtein1mRNAExpressionofRatswithHeatSyndromeByThyroidTabletsHUANGLi-ping1,2,PENGShu-hong2,MENGXiao-fang2,HUQiang2,CHENGKai-feng2,YURi-yao2,LIUHong-ling3,SUNJian-ning1

(11BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100102,China;

21JiangXiCollegeOfTraditionalChineseMedicine,Nanchang330006,Jiangxi,China;

31KeyLaboratoryofModernPreparation,MinistryofEducationJiangXiUniversityofTCM,Nanchang330004,Jiangxi,China)

Abstract:Objective:ToinvestigatetheeffectonfatmetabolismandUCP1mRNAexpressionofratswithheatsyndromebythyroidtablets.Method:Ratshavebeenadministratedwiththyroidtabletsin30days.Thenparametersweremeasuredasfollows¹ThebodyweightandtemperatureºSomeparametersoflipidinserum»ThecontentofFT3、FT4、TSHinserum¼ThemRNAexpressionofUCP1inbrownfattissue.Results:Someresultswerefoundonratswithheatsyndromebythyroidtabletsasfollows:¹Thetemperaturehasbeenincreasedsignificantly,thebodyweightgainhasbeendepressedsignificantly.ºThecontentoftotalcholestero,llow-densitylipoproteincholesterolandhavebeendepressedsignificantly,thecontentofFFAhavebeenincreasedsignificantly,andtheactivityofLPLandHLaswel.l»ThecontentofFT3,FT4havebeendepressedsignificantly.¼ThemRNAexpressionofUCP1hasbeenincreasedsignificantly.Conclusion:EnergymetabolismandthermogenesishavebeenpromotedonratswithHeatSyndromebythyroidtablets.

Keywords:thyroidtablets;energymetabolism;heatsyndromeofrat

中医寒热证模型的研究不仅为中医证型的形成机理和本质研究提供了有效的手段,同时也是开展中药寒热药性理论研究的一条重要的途径。近年来,许多学者采用/病毒感染法0、/热药法0、/甲状腺素法0、/肾上腺皮质激素法0等方法建立了众多中医实热证、虚热证动物模型,对于药性理论研究具有很大的意义[1]。本试验采用大剂量甲状腺素片灌胃给药复制大鼠热证模型,探讨了该模型脂肪代谢情况及棕色脂肪组织解耦联蛋白1(UCP1)mRNA表达,试图找出该热证模型中能量代谢规律,为开展中药寒热药性的理论研究提供一定的试验基础。1 实验材料111 动物 SD大鼠,雄性,体重(200?20)g,江西中医学院动物中心提供,许可证号:SCXK(赣)2006-0001。给予大鼠标准饲料和饮用水。112 药物及试剂 甲状腺片,浙江尖峰药业有限公司;考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒,游离脂肪酸测试盒,收稿日期:2009-06-17

基金项目:国家重点基础研究发展计划(973计划)资助项目

(2006CB504702);江西省教育厅项目(GJJ09276)

作者简介:黄丽萍(1972-),女,副教授,硕士生导师,博士研究生,主要

从事药理研究和教学工作。

通讯作者:刘红宁,Te:l0791-7118857;E-mai:llhongning@yahoo.com.

cn

1,2

2

2

2

2

2

3

1

均购自南京建成生物工程研究所;总脂酶试剂盒,购自南京凯基生物;T3放射免疫分析测试盒、T4放射免疫分析测试盒,TSH放射免疫分析测试盒均购自北京科美东雅生物技术有限公司。Trizol购自TransGen公司;反转录试剂盒购自Fermentas公司;荧光定量PCR试剂盒购自TaKaRa公司。所用引物通过引物设计软件oligo6自行设计,序列如下:内参基因B-actin参照#542#

GeneBank基因序列(NM-031144)设计,上游引物5'TGGGTATGGAATCCTGTG3c,下游引物5'GTGTTGGCATAGAGGTCTTT3c。UCP1基因参照GeneBank基因序列(NM-012682)设计,上游引物:5cCATTTACTGTCAGCTCTTGTC3c,下游引物:5cACTTGGGTACTGTCCTGGT3c。113 仪器 Beckman-CX7全自动血液生化仪(Beckman公司)、UV-2000型紫外可见分光光度计(尤尼柯上海仪器有限公司)、Labfuge400R台式低温离心机(德国Heraeus)、荧光定量PCR仪(BIOER)、电热恒温水浴锅、微量移液器、涡旋混匀器。2 实验方法211 动物分组与给药 大鼠20只,随机分为两组,即空白对照组、热证模型组,每组10只。动物适应性喂养3天后开始灌胃给药,热证模型组灌胃甲状腺片016g/kg,容积为10mL/kg,共给药30天。空白组给予等容量的蒸馏水。大鼠造模前及造模后每5天称体重1次,测肛温1次。212 试验取材 第31天将大鼠称重,麻醉后由心脏取血入离心管,2000r/min离心10min,分离血清,-80e冷冻保存备用。取睾丸,附睾及肾周脂肪并称重,计算出体脂系数。213 血清甘油三酯(TG)总胆固醇(TG)高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的测定 保存的血清4e解冻后充分混匀,取500LL按试剂盒说明书进行TG、TC、HDL-C、LDL-C测定。214 血清游离脂肪酸(FFA)脂蛋白脂酶(LPL)和肝脂酶(HL)的测定 保存的血清4e解冻后充分混匀, 辽宁中医杂志2010年第37卷第3期

取200LL按试剂盒说明书进行FFA的测定,取50LL按试剂盒说明书进行LPL及HL的测定。H测定 分离血清,取500LL放免215 血清T3T4TS法进行T3、T4、TSH含量测定。216 棕色脂肪组织UCP1mRNA表达量的检测[2] (1)mRNA提取及反转录:取棕色脂肪组织50~100mg加入1mlTrizo,l按照说明书步骤提取总RNA。紫外分光光度计测定RNA浓度及纯度,OD260/280=1178~211,所提取的RNA-70e储存备用。按反转录试剂盒说明进行cDNA合成。(2)mRNA的检测:取待测样品的cD-NA,按照荧光定量PCR试剂盒的说明书进行操作。反应总体积20LL,cDNA为1~2Lg,上游引物终浓度为015mM,下游引物终浓度为015LM。反应条件为:95e30s;95e5s及60e30s,共40个循环。最后做溶解曲线,以确定扩增产物的特异性。所有样品均重复检测3次,用2-$$CT方法来表示所检测样品相对于作为参照因$$

子样品的目的基因的表达倍数。CT=(CT,目的样本UCP-CT,目的B-actin)-(CT,参照样本UCP-CT,参照样本B-actin)。217 统计学方法 采用SPSS1115进行统计分析。资料经过方差齐性检验,数据用均数?标准差(󰀁x?s)表示。组间差异比较用t检验。3 实验结果311 甲状腺片所致热证模型大鼠体温和体重测定结果 结果见表1、2。模型组大鼠灌胃甲状腺片后第5天开始大鼠肛温升高,第10、20、25、30天肛温的上升与空白对照组比较有显著性意义(P<0105,P<0101)。模型组造模后体重较空白组低,其中在第15、20、25、30天均有显著性意义(P<0105,P<0101)。表1 甲状腺片所致热证模型大鼠体温(n=10,󰀁x?s)

组别

剂量(g#kg-1)

-016

给药前体温

(e)36181?013036150?0158

第5天37116?013537146?0141

第10天37113?0136

*

37151?0138

给药后体温(e)第15天37115?013337148?0140

第20天36198?011737171?0131*

*

第25天36176?012037149?0131*

*

第30天37103?0141

*37149?0163

空白对照组热证模型组

注:与空白对照组比较,*P<0105,**P<0101。

表2 甲状腺片所致热证模型大鼠体重(n=10,󰀁x?s)

剂量

组别

(g#kg-1)

-016

给药前体重

(g)233110?21127229150?17173

第5天264140?25110259100?22104

第10天281150?26177271190?22159

给药后体重(g)第15天289170?21175241100?29162*

*

第20天302180?23172

*

278140?25131

第25天340130?26121

*293190?27151

*

第30天342100?28154

*

308144?34163

空白对照组热证模型组

注:与空白对照组比较,*P<0105,**P<0101。

312 甲状腺片所致热证大鼠血清TGTCHDL-CLDL-C含量 结果表3。与空白组比较,模型组大鼠TG、TC、HDL-C、LDL-C含量均下降,其中以TC和LDL-C的下降且有统计学意义(P<0101)。313 甲状腺片所致热证大鼠血清FFALPLHP及体脂系数的测定结果 结果见表4。与空白组比较,热证模型大鼠FFA、LPL、HP含量均上升,且有极显著统计学意义(P<0101)。体脂系数降低,但其降低无统计学意义。表3 甲状腺片所致热证模型大鼠TGTCHDL-C

及LDL-C的含量(mmol/L,x󰀁?s)

剂量

组别

(g#kg-1)

)016

n99

TG

TC

HDL-C

LDL-C0123?0105

*

0116?0105

空白对照组热证模型组

0154?01341144?01251111?01460138?01071110?0132*1100?0131

注:与空白对照组比较,*P<0105,**P<0101。 辽宁中医杂志2010年第37卷第3期

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甲状腺激素是影响机体能量代谢的主要物质,能使细胞内氧化速度提高,耗氧量增加,产热增多。具有刺激脂肪合成和促进脂肪分解的双重功能,但总的作用结果是减少脂肪的贮存,降低血脂浓度。在增加基础代谢,促进物质氧化,升高产热中具有重要作用。促甲状腺激素(TSH)是垂体前叶分泌的一种糖蛋白激HL(mmol/L)

体脂系数(g/100g体重)

314 甲状腺片所致热证大鼠血清T3T4TSH的测定结果 结果见表5。与空白组比较,阴虚内热证大鼠血清T3、T4、TSH含量均下降,T3、T4的降低且有极显著统计学意义(P<0101)。表4 甲状腺片所致热证模型大鼠血清FFALPLHL

及体脂系数(x󰀁?s)

剂量

组别

(g#kg

-1

n)

(Lmol/L)

(mmol/L)

FFA

LPL

素,其主要作用是调控甲状腺的功能活动。本实验研FT4及TSH含量减少,究发现,热证动物血清中FT3、可能是由于长期给予外源性的甲状腺片,负反馈性抑T4释放入血减少所制的TSH,从而导致内源性的T3、致。解偶联蛋白家族(UCPs)作为一种线粒体转运蛋白,在调节机体产热和能量代谢方面发挥着重要作用。当线粒体中有更多的燃料被氧化时,所释放的能量以热能的形式释放出来,而不是形成ATP[6]。目前已发现5种不同的UCPs家族成员,其氨基酸组成具有不同程度的同源性。UCP1主要在棕色脂肪组织(BAT)中表达,BAT中的UCP1可产生热能,减少ATP的合成,因此,UCP1在啮齿类动物中有产生热量以维持体温的重要作用。本实验发现,与空白组比较,热证大鼠棕色脂肪组织UCP1的表达量显著增加,其增加与模型动物体温的升高是一致的。甲状腺素是能量代谢调节的重要因素,许多研究证明甲状腺素能促进棕色脂肪组织中UCP1mRNA的表达[7-8],在本试验中,棕色脂肪组织UCP1的表达量在甲状腺素片热证模型组显著增加,与前人报道结果一致。综上所述,灌胃给予甲状腺片所致热证大鼠体温升高,体重增加缓慢,脂肪代谢呈加快的趋势,这与以往的报道热证时物质代谢机能旺盛而寒证时低下相吻合,该动物模型能否作为研究中药药性理论的热证动物模型,还有待于进一步的实验研究。参考文献

[1] 刘亚梅.中医实热证、虚热证实验研究新探[J].中医药学报,

2006,34(2):58-68.

[2] LivakJ,SchmittgenTD.Analysisofrelativegeneexpressiondatausing

real-timequantitativePCRandthe2-$$CTmethod[J].Methods,2001,25:402-408.

[3] 成秀梅,杜惠兰.中医寒热证动物模型的研究[J].河北中医药学

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[4] 吴斌,温万芬,王米渠,等.寒热实验研究进展及前瞻[J].四川中

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IImediatedreversecholesterolsportisinhibitedbyadvancedglyca-tionendproducts.[J].BiolChem,2001,276:13348-13355.[6] KraussS,ZhangCY,LowellBB.Themitochondrialuncoupling-protein

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空白对照组-10502160?88147**

750112?168132

1108?0125**

1182?0164

0171?0113**

1113?0124

10104?2144

热证模型组01698141?1171

注:与空白对照组比较,*P<0105,**P<0101。

表5 甲状腺片所致热证模型大鼠血清FT3FT4TSH含量(x󰀁?s)

剂量

组别

(g#kg-1)

-016

n

FT3(mmol/L)2130?01371167?0143

**

FT4(mmol/L)9165?21742132?1146

**

TSH(LIU/mL)1194?01671175?0149

空白对照组热证模型组

99

注:与空白对照组比较,*P<0105,**P<0101。

315 甲状腺片所致热证大鼠UCP1mRNA的表达量 结果见表6。与空白组比较,热证大鼠棕色脂肪组织UCP1的表达量显著增加(P<0105)。表6 甲状腺片所致热证模型大鼠棕色脂肪组织

UCP1mRNA的表达(󰀁x?s)

组别空白组热证模型组

剂量(g#kg-1)

-016

n55

UCP1(相对于B-actin的表达量)

0194?0149

*

1189?0141

注:与空白对照组比较,*P<0105。

4 讨 论目前用于制作热证动物模型的方法有多种[3],但由于多种原因存在着各种的不足和缺陷。采用甲状腺素造模具有方法简便、成功率高、死亡率低、稳定性强、重复性好、实施方便等优点[4],且动物实验发现,该模型症状表现及各种生化指标变化与/阴虚内热0的临床表现相似,与临床病人阴虚火旺证表现比较一致,故我们选用甲状腺片长期灌胃给药来复制热证动物模型。从我们实验结果来看,大鼠给予甲状腺片灌胃后,体温明显升高,体重较空白组低,提示模型的复制是成功的。TC是指血液中所有脂蛋白所含胆固醇之总和,TC包括游离胆固醇和胆固醇酯。TG是机体储存能量及氧化供能的重要形式。脂蛋白脂酶(LPL)和肝脂酶(HL)都是脂蛋白代谢的关键酶,是血液循环中与内源性TG代谢有关的两种关键酶。本实验研究发现,热证动物血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C含量均下降,而FFA、HL、LPL的含量均增加,同时动物的体脂系数下降,提示该动物模型无论是体脂还是血脂的代谢均加快,通过对TG、TC的分解,FFA的生成增加,产生更多的能量以维持机体的高代谢状态。