*CN102071249A*
(10)申请公布号 CN 102071249 A(43)申请公布日 2011.05.25
(12)发明专利申请
(21)申请号 200910228703.9(22)申请日 2009.11.25
(71)申请人贵州仁怀茅台镇金士酒业有限公司
地址564501 贵州省仁怀市茅台镇金士力路
56号(72)发明人闫希军 李长文 梁慧珍 张春辉
李季(74)专利代理机构北京华科联合专利事务所
11130
代理人王为(51)Int.Cl.
C12Q 1/68(2006.01)C12R 1/645(2006.01)C12R 1/85(2006.01)C12R 1/785(2006.01)C12R 1/07(2006.01)C12R 1/01(2006.01)
权利要求书 3 页 说明书 11 页 附图 4 页
(54)发明名称
一种酱香型白酒大曲的鉴定方法(57)摘要
本发明涉及一种白酒大曲中微生物的提取方法，特别是酱香型白酒大曲中真菌DNA和细菌DNA的提取方法以及用该方法在鉴定白酒方面的应用。
CN 102071249 ACN 102071249 ACN 102071253 A
权 利 要 求 书
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1.一种白酒大曲的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)取已知类型的大曲样品；用方法1进行DGGE指纹图谱测定，对DGGE指纹图谱进行聚类及半定量分析；用方法2进行总DNA序列测定，确定优势真菌和细菌菌群结构；
2)取已知类型的大曲样品；用方法1进行DGGE指纹图谱测定，对DGGE指纹图谱进行聚类及半定量分析；用方法2进行总DNA序列测定，确定优势真菌和细菌菌群结构；
3)将待测样品与已知类型的大曲的优势菌群比对，两者相符为同类型；其中所述方法1包括以下步骤：取大曲样品，提取样品的总DNA；以总DNA为模板，进行PCR扩增；进行变性梯度凝胶电泳，EB染色后得到DGGE指纹图谱；其中所述方法2包括以下步骤：取大曲样品，提取样品的总DNA；以总DNA为模板，进行PCR扩增；进行变性梯度凝胶电泳，根据方法1的指纹图谱聚类及半定量分析结果，回收优势条带，并以此为模板，进行PCR扩增，对目的片段进行序列测定。
2.权利要求1的鉴定方法，其特征在于，其中所述总DNA包括样品中真菌和细菌的总DNA。
3.权利要求2的鉴定方法，其特征在于，其中所述真菌总DNA提取方法是：提取缓冲液提取两次；氯仿抽提一次；异丙醇沉淀过夜；离心。其中提取缓冲液的加量是样品量的3-6倍，所加氯仿的体积与上清液的体积相同，异丙醇加量是上清液体积的0.6-0.7倍；
细菌总DNA提取方法是：提取缓冲液提取一次，加蛋白酶K和溶菌酶，氯仿抽提两次，异丙醇沉淀过夜；其中提取缓冲液的加量是样品量的10-25倍，20mg/mL蛋白酶K和25mg/mL溶菌酶的加量分别是50-100μl和0.5-1ml，氯仿加量与上清液相同，异丙醇加量是上清液体积的0.6-0.7倍。
4.权利要求1的鉴定方法，其特征在于，其中所述方法1中所述扩增包括，以样品的真菌的总DNA或细菌的总DNA为模板，在专用引物的引导下进行PCR扩增，扩增结束后，对目的片段进行回收及纯化；
对于真菌总DNA的PCR扩增，其专用引物为GeoA2：5′-CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC-3′和Geo11：5′-ACCTTGTTACGACTTTTACTTCC-3′；PCR扩增条件为巢式PCR扩增：先加入扩增18S rDNA全长的引物和反应体系进行第一步扩增；PCR反应条件为：94℃预变性4min，然后在94℃变性45s，50℃-55℃引物复性45s，72℃引物延伸1.5min，循环30次，72℃终延伸10min；取其产物进行100倍稀释后作为模板，以16S rDNA V3可变区为目标进行扩增，PCR反应条件为：94℃预变性4min，然后在94℃变性45s，50-55℃引物复性45s，72℃引物延伸1min，循环30-35次，72℃终延伸10min；
对于细菌总DNA的PCR扩增，其专用引物为8-27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1378-1401R：5’-TACCTTGTTACGACTT-3’。PCR扩增条件为巢式PCR扩增：先加入扩增16S rDNA全长的引物和反应体系进行扩增；PCR反应条件为：94℃预变性4min，然后在94℃变性45s，50℃-55℃引物复性45s，72℃引物延伸1.5min，循环30次，72℃终延伸10min；取其产物进行100倍稀释后作为模板，以16S rDNA V3可变区为目标进行扩增，PCR反应条件为：94℃预变性4min，然后在94℃变性45s，50-55℃引物复性45s，72℃引物延伸1min，循环30-35次，72℃终延伸10min。
5.权利要求1的鉴定方法，其特征在于，其中所述序列测定，是对纯化的目的片段进行变性梯度凝胶电泳(DGGE)，其点样量为600-1000ng，用E.B(溴化乙锭)染色后得到测序用
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指纹图谱；为避免条带缺失，可先通过预试得到DGGE适宜的丙烯酰胺浓度梯度范围及所用时间。
制备聚丙烯酰胺变性梯度凝胶的变性梯度为20％，40％，60％，80％，使用的电泳缓冲液为0.5×TAE，上样量为200ng，电压80-120V，60℃，电泳10h，溴化乙锭染色20-30min，可得出清晰准确的DGGE图谱，得出制备聚丙烯酰胺变性梯度凝胶的变性梯度为35％～60％；
将电泳时间分别确定为4h，6h，8h，10h，12h，14h，16h，每隔4h进样一次，上样量为200ng，电压80V，温度60℃，得到DGGE谱图，可以确定所用时间可以为8-12h。
6.权利要求1的鉴定方法，其特征在于，其中所述对真菌DNA进行的DGGE指纹图谱聚类及半定量分析，可确定酱香白酒大曲不同生产时期细菌菌群结构的关系及各个条带所代表的真菌在全部优势真菌菌群中的比例，即相对丰度；对细菌DNA进行的DGGE指纹图谱聚类及半定量分析，可确定酱香白酒大曲不同生产时期细菌菌群结构的关系及各个条带所代表的细菌在全部优势菌群中的比例，即相对丰度；
两种微生物均可用Bio-ID++软件进行半定量分析，计算公式为：相对丰度Pi(％)＝100×ODi/OD，其中ODi为选定条带i的光密度，OD为全部条带的光密度之和。
7.权利要求1的鉴定方法，其特征在于，其中方法2中，根据DGGE指纹图谱聚类及半定量分析结果，回收相对丰度高于1％的优势条带，并以此为模板，在不含GC夹子的专用引物的引导下进行PCR扩增，扩增结束后，对目的片段进行回收、纯化及测序；
其中对于真菌DNA的PCR扩增，其专用引物为NS31-GC：5′-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGTTGGAGGGCAAGTCTGGTGCC-3′Glol：5′-GCCTGCTTTAAACACTCTA-3′。为获得更好的检测效果，所述第二步的上游引物的5’端还添加有40个GC夹子，添加有40个GC夹子的上游引物序NS31-GC：5′-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGTTGGAGGGCAAGTCTGGTGCC-3′；
其中对于细菌DNA的PCR扩增，其专用引物为968FGC：5’-CGC CCG GGG CGCGCC CCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAA CGC GAA GAA CCT TAC-3’和R1041：5’-CGGTGTGTACAAGACCC-3’；为获得更好的检测效果，所述第二步的上游引物的5’端还添加有40个GC夹子，添加有40个GC夹子的上游引物序968FGC：5’-CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAA CGCGAA GAA CCT TAC-3’。
8.权利要求1的鉴定方法，其特征在于，其中所述比较可采用Blast程序在线(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)对测序结果进行序列比对分析，确定大曲优势菌群结构。
9.权利要求1的鉴定方法，其特征在于，其中所述鉴定方法适用于所有酿造用曲，如酿酒用的高温大曲，中温大曲，低温大曲，小曲等及其酱油，醋等酿造过程中所有微生物的菌群分析和优势菌群的确定；优选适用于酿酱香高温大曲，浓香高温曲，中温曲等；进一步优选适用于酱香型的白酒大曲，最优选适用于酱香型白酒高温大曲。
10.权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于酱香白酒大曲中细菌的优势菌群是：Uncultured bacterium，Virgibacillus sp.，Bacillus sp.和Thermoactinomyces sp.。
Saccharomycopsis fibuligera 酱香白酒大曲中真菌的优势菌群是：Saccharomyces sp.，
strain和Mucor sp.。
11.权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于酱香白酒大曲中细菌的优势菌群中，四个
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优势细菌的菌量比例是2∶1∶1∶2；优势真菌菌量比例是1∶1∶4；优势细菌：优势真菌的菌量比是4∶1.5。
12.一种白酒大曲总DNA DGGE指纹图谱的测定方法，该方法包括以下步骤：1)取大曲样品，
2)提取样品的总DNA；3)以总DNA为模板，进行PCR扩增；4)进行变性梯度凝胶电泳，EB染色后得到DGGE指纹图谱。
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说 明 书
一种酱香型白酒大曲的鉴定方法
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技术领域
[0001]
本发明涉及一种白酒大曲中微生物的提取方法，特别是酱香型白酒大曲中真菌
DNA和细菌DNA的提取方法以及用该方法在鉴定白酒方面的应用。
背景技术
[0002] 大曲是指含有大量能发酵的活微生物或酶类的糖化发酵剂。制曲技术是我国特有的一份民族遗产，在曲与酒的关系上，曲是占先导地位的。俗语说“有美酒必备佳曲”“曲为，酒骨”。而且更重要的是关系到香型风味的重要成因。曲中的微生物不同，香型就不同，选育优良菌种应用于白酒酿造一直是行业技术工作的重点。[0003] 目前酱香白酒大曲中微生物的研究，主要是应用传统微生物分离、纯化、鉴定等方法。传统的研究方法是首先从特定自然环境(如大曲房)中取样，采用模拟自然环境的各种培养基和条件进行分离培养，通过纯培养获得菌株后，再对其表型特征、细胞的性质(形态学、生理生化反应和细胞组成成分结构的观察)进行观察收集，同时进行一系列繁杂的形态特征和生理生化实验，才能对其特性进行描述，这种方法又被称作经典方法。[0004] 应用传统方法可以分离培养的微生物不一定是优势菌群，只是它们适合并能够在人工培养条件下被分离纯化，不能动态反映大曲微生物菌群的生长状态。在实验技术上，大曲研究仍停留在细胞水平，主要研究细菌、霉菌、酵母和放线菌单一的菌落形态和纯种的生长特性。在实验结果上，不能反映分离物间的系统发育关系，不能获得微生物多样性的真正概貌。因此传统的依靠培养的方法制约了人们对微生物生态的客观认识，对于人们正确认识微生物群落结构与功能，正确认识微生物资源，正确开发并利用这些资源造成了严重的障碍。
[0005] 变性梯度凝胶电泳(DGGE)最初被用于基因的突变检测，任意位点的单碱基突变的DNA片段和原始的DNA片段能被分开，经过序列测定和比较就可以找出突变的位点。变性梯度凝胶电泳对不同DNA片段的分离原理是变性梯度凝胶电泳(DGGE)中同样长度但具有不同序列的DNA片段能够被分离，因为在含有呈线形增加梯度变性剂(尿素和甲酰胺)的混合物的聚丙烯酰胺凝胶电泳中部分解链的双链DNA分子的电泳迁移率降低。具有不同序列的DNA分子有不同的解链行为，将在凝胶的不同位置停止迁移。变性梯度凝胶电泳(DGGE)自1993年以来被用于环境微生物领域来研究环境样品中微生物的群落结构，它是建立在PCR反应对环境样品中的所有微生物的16S rRNA(原核生物)和18S rRNA(真核生物)等保守基因区间的DNA片断的扩增的基础上，这些被扩增出的DNA片断可以代表所有不同微生物的信息，这些使用同一引物对扩增出的不同微生物的DNA片断具有相同的碱基数，因此一般的电泳无法将它们分离开，这就为后续的进一步研究提出了新的问题。由于变性梯度凝胶电泳(DGGE)可以将不同碱基顺序的相同大小的DNA片段予以分离，所以PCR-DGGE可以对环境样品中的微生物群落进行研究。
[0006]
目前，国内外尚无关于运用PCR-DGGE技术进行酱香白酒大曲微生物群落构成研
究的相关报道。然而酱香大曲与城市污水厂污泥和农田土壤的化学、物理性质高度异质，微
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说 明 书
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生物数量和种群分布也明显不同，这就决定了不同环境下的样品在进行微生物群落构成分析时存在差异。由于酱香高温大曲样品中所含的成分复杂，含有多量的蛋白质、氨基酸和多糖等成分，微生物种类繁多，从中提取出高质量的微生物总DNA的难度较大。经过多次的实验最终找到一种适合酱香高温大曲的总DNA的提取方法，为了除去蛋白，以及多糖等杂质，本发明的方法只用氯仿抽提即可，用70％冷乙醇冲洗所得沉淀，节省时间，成本低，可以对酱香大曲中的各种菌的总DNA无偏好的进行提取。找到了利用PCR-DGGE技术对酱香白酒大曲进行鉴定的方法。
[0007] 本发明通过DNA的提取发现了酱香型白酒大曲中的优势菌群，包括真菌优势菌群和细菌优势菌群。
[0008] 本发明的发现可以用于白酒的鉴定，如将待测白酒样品通过提取总DNA确定优势菌群，和已经确定的白酒优势菌群(材料里有)进行比对，以判断待测白酒的种类。发明内容
本发明提供一种白酒大曲的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：[0010] 1)取已知类型的大曲样品；用方法1进行DGGE指纹图谱测定，对DGGE指纹图谱进行聚类及半定量分析；用方法2进行总DNA序列测定，确定优势真菌和细菌菌群结构。[0011] 2)取已知类型的大曲样品；用方法1进行DGGE指纹图谱测定，对DGGE指纹图谱进行聚类及半定量分析；用方法2进行总DNA序列测定，确定优势真菌和细菌菌群结构。[0012] 3)将待测样品与已知类型的大曲的优势菌群比对，两者相符为同类型。[0013] 其中所述方法1包括以下步骤：取大曲样品，提取样品的总DNA；以总DNA为模板，进行PCR扩增；进行变性梯度凝胶电泳，EB染色后得到DGGE指纹图谱；[0014] 其中所述方法2包括以下步骤：取大曲样品，提取样品的总DNA；以总DNA为模板，进行PCR扩增；进行变性梯度凝胶电泳，根据方法1的指纹图谱聚类及半定量分析结果，回收优势条带，并以此为模板，进行PCR扩增，对目的片段进行序列测定；
[0015] 经过以上测定方法测定，酱香白酒大曲中细菌的优势菌群是：Unculturedbacterium，Virgibacillus sp.，Bacillus sp.和Thermoactinomyces sp.。酱香白酒大曲中真菌的优势菌群是：Saccharomyces sp.，Saccharomycopsis fibuligera strain和Mucor sp.。四个优势细菌的菌量比例是2∶1∶1∶2；优势真菌菌量比例是1∶1∶4；优势细菌∶优势真菌的菌量比是4∶1.5。[0016] 本发明特别适合酱香白酒大曲的鉴定。[0017] 本发明的方法，其中所述总DNA可以使样品中真菌的总DNA，也可以是细菌的总DNA，
[0018] 真菌DNA提取方法是：提取缓冲液提取两次；氯仿抽提一次；异丙醇沉淀过夜；离心。其中提取缓冲液的加量是样品量的3-6倍，所加氯仿的体积与上清液的体积相同，异丙醇加量是上清液体积的0.6-0.7倍。[0019] 细菌DNA提取方法是：提取缓冲液提取一次；加蛋白酶K和溶菌酶；氯仿抽提两次；异丙醇沉淀过夜。其中提取缓冲液的加量是样品量的10-25倍，20mg/mL蛋白酶K和25mg/mL溶菌酶的加量分别是50-100μl和0.5-1ml，氯仿加量与上清液相同，异丙醇加量是上清液体积的0.6-0.7倍。
[0009]
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本发明的方法中，方法1中所述扩增包括，以样品的真菌的总DNA或细菌的总DNA为模板，在专用引物的引导下进行PCR扩增，扩增结束后，对目的片段进行回收及纯化。[0021] 对于真菌总DNA的PCR扩增，其专用引物为GeoA2：5′-CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC-3′和Geol1：5′-ACCTTGTTACGACTTTTACTTCC-3′。PCR扩增条件为巢式PCR扩增：先加入扩增18S rDNA全长的引物和反应体系进行第一步扩增；PCR反应条件为：94℃预变性4min，然后在94℃变性45s，50℃-55℃引物复性45s，72℃引物延伸1.5min，循环30次，72℃终延伸10min；取其产物进行100倍稀释后作为模板，以16S rDNA V3可变区为目标进行扩增，PCR反应条件为：94℃预变性4min，然后在94℃变性45s，50-55℃引物复性45s，72℃引物延伸1min，循环30-35次，72℃终延伸10min。[0022] 对于细菌总DNA的PCR扩增，其专用引物为8-27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1378-1401R：5’-TACCTTGTTACGACTT-3’。PCR扩增条件为巢式PCR扩增：先加入扩增16S rDNA全长的引物和反应体系进行扩增；PCR反应条件为：94℃预变性4min，然后在94℃变性45s，50℃-55℃引物复性45s，72℃引物延伸1.5min，循环30次，72℃终延伸10min；取其产物进行100倍稀释后作为模板，以16S rDNA V3可变区为目标进行扩增，PCR反应条件为：94℃预变性4min，然后在94℃变性45s，50-55℃引物复性45s，72℃引物延伸1min，循环30-35次，72℃终延伸10min。[0023] 本发明所述序列测定，是对纯化的目的片段进行变性梯度凝胶电泳(DGGE)，其点样量为600-1000ng，用E.B(溴化乙锭)染色后得到测序用指纹图谱。为避免条带缺失，可先通过预试得到DGGE适宜的丙烯酰胺浓度梯度范围及所用时间。[0024] 制备聚丙烯酰胺变性梯度凝胶的变性梯度为20％，40％，60％，80％，使用的电泳缓冲液为0.5×TAE，上样量为200ng，电压80-120V，60℃，电泳10h，溴化乙锭染色20-30min，可得出清晰准确的DGGE图谱(见图1)。得出制备聚丙烯酰胺变性梯度凝胶的变性梯度为35％～60％。
[0025] 将电泳时间分别确定为4h，6h，8h，10h，12h，14h，16h，每隔4h进样一次，上样量为200ng，电压80V，温度60℃，得到DGGE谱图(见图2)。可以确定所用时间可以为8-12h。[0026] 本发明所述对真菌DNA进行的DGGE指纹图谱聚类及半定量分析，可确定酱香白酒大曲不同生产时期细菌菌群结构的关系及各个条带所代表的真菌在全部优势真菌菌群中的比例，即相对丰度。对细菌DNA进行的DGGE指纹图谱聚类及半定量分析，可确定酱香白酒大曲不同生产时期细菌菌群结构的关系及各个条带所代表的细菌在全部优势菌群中的比例，即相对丰度；
[0027] 两种微生物均可用Bio-ID++软件进行半定量分析，计算公式为：相对丰度Pi(％)＝100×ODi/OD，其中ODi为选定条带i的光密度，OD为全部条带的光密度之和。[0028] 本发明方法2中，根据DGGE指纹图谱聚类及半定量分析结果，回收相对丰度高于1％的优势条带，并以此为模板，在不含GC夹子的专用引物的引导下进行PCR扩增，扩增结束后，对目的片段进行回收、纯化及测序。[0029] 其中对于真菌DNA的PCR扩增，其专用引物为NS31-GC：5′-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGTTGGAGGGCAAGTCTGGTGCC-3′[0030] Glol：5′-GCCTGCTTTAAACACTCTA-3′。为获得更好的检测效果，所述第二步的上游引物的5’端还添加有40个GC夹子，添加有40个GC夹子的上游引物序NS31-GC：5′-C
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GCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGTTGGAGGGCAAGTCTGGTGCC-3′。[0031] 其中对于细菌DNA的PCR扩增，其专用引物为968FGC：5’-CGC CCG GGG CGCGCC CCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAA CGC GAA GAA CCT TAC-3’和R1041：5’-CGGTGTGTACAAGACCC-3’。为获得更好的检测效果，所述第二步的上游引物的5’端还添加有40个GC夹子，添加有40个GC夹子的上游引物序968FGC：5’-CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAA CGCGAA GAA CCT TAC-3’。
[0032] 本发明所述比较可采用Blast程序在线(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)对测序结果进行序列比对分析，确定大曲优势菌群结构。[0033] 本发明的鉴定方法适用于所有酿造用曲，如酿酒用的高温大曲，中温大曲，低温大曲，小曲等及其酱油，醋等酿造过程中所有微生物的菌群分析和优势菌群的确定。优选适用于酿酱香高温大曲，浓香高温曲，中温曲等。进一步优选适用于酱香型的白酒大曲，最优选适用于酱香型白酒高温大曲。[0034] 本发明的优点在于：
[0035] 采用本发明直接提取酱香大曲样品中的总DNA进行鉴定，避免了在传统培养过程中的筛选和富集作用，能更直接真实地反应大曲样品中的微生物多样性及种群分布情况，较传统培养、分离和鉴定也更为简易、准确，尤其在大曲的鉴定上利用优势微生物的确定就可以对大曲进行鉴定。
针对大曲有机物质含量比环境中的多且成分复杂，在DNA提取过程中酚-氯
仿-异戊醇(体积比，25∶24∶1)抽提，异丙醇沉淀过夜，就能很好的提取总DNA，不经试剂盒纯化直接用于后续的分子生物学分析。可以对酱香大曲中的各种细菌的总DNA无偏好的进行提取。
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[0037] 大曲微生物中的数量一般在10-10，比环境中土壤和污泥中的数量相对少一些，因此进行两次PCR扩增；通过梯度凝胶电泳技术，可在适宜条件下对不同菌群实施分离。用快速银染法获得DGGE指纹图谱，通过E.B染色获取测序用指纹图谱，在一定程度上克服了可恢复性银染技术的不确定性；
[0038] 结合Bio-ID++软件对优势菌群进行半定量分析，以及通过测序比对完成的菌群定性分析，结果准确、可靠，逐步克服了常规的人工培养法对大曲菌群结构进行分析的不足。
[0039] 此方法除了可以酱香白酒大曲进行鉴定外，还可以对不同区域不同大曲种类进行微生物群系分析。克服了需要感官和各种理化指标来进行模糊判断的大曲鉴定方法。
[0036]
附图说明
图1不同变性浓度的DGGE谱图
[0041] 图2不同时间下的DGGE谱图
[0042] 图3酱香高温大曲生产过程及不同质量成品曲中细优势真菌菌群及PCR-DGGE谱图
[0040]
E--出仓曲 B--黑曲 Y--黄曲 W-白曲 S--二次翻曲 O--一次翻曲
[0044] I--入仓曲 M--母曲
[0045] 图4酱香高温大曲生产过程中细菌的优势菌群及PCR-DGGE谱图
[0043]
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说 明 书
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图5酱香成品曲的PCR-DGGE谱图
[0047] Y-黄曲 M-母曲 B-黑曲 W-白曲[0048] 图6不同大曲样品的PCR-DGGE谱图具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
[0050] 实施例1[0051] 一、真菌DNA[0052] 1、准备样品
[0053] 对贵州茅台镇金士酒业有限公司酱香白酒大曲生产车间生产的大曲进行取样，在制曲过程中按一个周期中的不同时间取样，本实验用的酱香高温大曲样品是在贵州茅台镇金士酒业有限公司大曲生产车间取样。[0054] 2、总DNA的提取及纯化
[0055] 取3-6g大曲+25mL磷酸缓冲液(pH8.0)+0.1％PVPP，+1mL土温(80或60)摇床30min，超声6-7min，静置2-5min，，沉淀低速(1000rpm)离心5min，取出上清，混合，高速(9000rpm)离心8min，去除上清，再加入磷酸缓冲液(PVPP)，25mL，打散后高速离心(9000rpm)8min，去上清。
[0056] 加10-15mL提取液(提取液成分是：100mM Tris-HCl(三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐)pH8.0，100mM sodium EDTA(乙二胺四乙酸二钠)pH8.0，200mM NaCl，1％PVP，2％CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)pH8.0)，摇匀。在180run/min，37℃条件下振荡30min，加2mL 20％SDS继续振荡10min。65℃水浴1h后6000g离心15min，收集上清液，加0.5倍体积PEG(聚乙二醇)(30％)-NaCl(1.6mol/L)，混匀后室温下静止2h，在10000g离心20min，加4MNaAC(pH5.4)至终浓度0.3mol/L，用酚-氯仿-异戊醇(体积比，25∶24∶1)抽提一次，0.6倍体积异丙醇沉淀过夜，12000g离心20min，沉淀干燥后，20-200μL TE溶解，-20℃冰箱中保存备用。
[0057] 基因组DNA的纯化方法为采用美国OMEGA BIO-TEK公司生产的PCR产物纯化试剂盒，按照用户使用说明来进行。[0058] 3、PCR扩增及产物回收、纯化
[0059] 对纯化后的DNA进行PCR扩增，第一步扩增采用的引物为GeoA2：5′-CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC-3′和Geol1：5′-ACCTTGTTACGACTTTTACTTCC-3′
[0049]
第二步扩增采用的引物为：NS31-GC：5′
[0061] -CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGTTGGAGGGCAAGTCTGGTGCC-3′Glol：5′-GCCTGCTTTAAACACTCTA-3′。
[0062] 以上引物全部由上海生工生物工程技术有限公司合成。
[0063] 先加入扩增18S rDNA全长的引物和反应体系进行第一步扩增，50μl的PCR反应体系组成如下：10ng的DNA模板(一般用1μl)、50pmol每种引物、1μl dNTPs、5μl的10×PCRbuffer、2.5mmol/L的MgCl2、1.5-3U的Taq DNA聚合酶，适量的双蒸水补足50μl。PCR反应条件为：94℃预变性4min，然后在94℃变性45s，50℃引物复性45s，72℃引物延伸1.5min，循环30次，72℃终延伸10min；取其产物进行100倍稀释后作为模板，以18S rDNA
[0060]
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CN 102071249 ACN 102071253 A
说 明 书
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为目标进行扩增，PCR反应条件为：94℃预变性4min，然后在94℃变性45s，55℃引物复性45s，72℃引物延伸1min，循环35次，72℃终延伸10min，16S rDNA全长序列扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测；取其产物进行100倍稀释后作为模板，以18S rDNA为目标进行扩增，PCR反应条件为：94℃预变性4min，然后在94℃变性45s，55℃引物复性45s，72℃引物延伸1min，循环35次，72℃终延伸10min，目的产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测。电泳缓冲液为1×TAE缓冲液。
[0064] 取全部样品进行2％琼脂糖凝胶电泳(80V，50min)，在紫外灯下切胶回收230bp的目的条带，用CyCle-Pure DNA纯化试剂盒并按照试剂盒说明书对目的片段进行纯化，纯化后取3ul纯化产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果表明获得了纯度较高的目的片段。
[0065] 4、变性梯度凝胶电泳(DGGE)及凝胶成像扫描与分析
TM
[0066] 采用DCODE系统(BIO-RAD)构建DGGE指纹图谱，具体方法为：将等量的步骤三获得的样品的18S扩增纯化产物(约230bp)混合，取200ng用10％变性聚丙烯酞胺凝胶电泳进行分离(丙烯酞胺浓度0-100％，电泳缓冲液0.5 x TAE，80V，16h)，然后切下目的泳道区域，用E.B对变性聚丙烯酞胺凝胶染色，用Vilber凝胶成像扫描系统对银染条带进行照像，结果如图1所示，对图1进行分析，确定适宜的DGGE丙烯酰胺浓度范围为35％-60％。再取混合DNA样品，按100ng点样量、200ng点样量(3个平行)及300ng点样量在上述丙烯酰胺适宜的浓度范围内用10％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，其余操作同上。在Vilber凝胶成像扫描系统中对银染条带进行照像，结果显示100ng点样量的泳道损失2条条带，200ng点样量与300ng点样量所得到的指纹图谱一致，并且200ng点样量3个平行样的指纹图谱完全一样，表明DGGE技术具有可重复性。取相同的点样量200ng，做DGGE谱图，找出最佳电泳时间，见图2，图中可以看出10h时，条带最清晰，因此选用DGGE时间为10h。[0067] 上述预试结果表明，将各样品18S扩增纯化产物在10％聚丙烯变性胶中分离(丙烯酞胺浓度35％-60％，电泳缓冲液0.5-1 x TAE)，100V，12h，样品点样量200ngDNA(重复I)、另设一组点样量1000ng DNA(重复II)。[0068] 将重复I所在泳道区域切下，用快E.B染法对其进行染色。在vilber凝胶成像扫描系统中对染色条带进行照像，照相结果及其模式图见附图3所示，用BiO-ID++软件对该DGG E指纹图谱进行半定量分析，确定酱香高温大曲生产过程中菌群结构的关系及各个条带所代表真菌群在全部优势菌群的比例，即相对丰度，相对丰度Pi(％)＝100 xODi/OD[0069] 其中ODi为选定条带i的光密度，OD为全部条带光密度之和。
[0070] 表1 18SrDNA扩增纯化产物DGGE指纹图谱中酱香高温大曲在生产过程中及不同质量成品曲真菌优势菌群相对丰度(％)
[0071] 条带位置 E B Y W S O I M[0072] 1 -- -- -- -- -- -- -- 5.0[0073] 2 -- -- -- 9.5 -- -- 9.5 --[0074] 3 -- -- -- -- -- -- 4.5 --4 9.0 -- -- 9.5 -- 9.5 9.5 --[0076] 5 -- -- -- -- -- 5.0 -- --[0077] 6 -- -- -- -- 9.0 -- -- --[0075]
10
CN 102071249 ACN 102071253 A[0078]
说 明 书
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7 -- -- 6.5 -- -- -- -- --[0079] 将重复II所在泳道区域切下，按E.B染色。[0080] 5、优势条带的回收、测序与序列比对分析
[0081] 在紫外灯下将重复II所在泳道的明显条带用无菌手术刀小心割下，并在银染图谱中标记相应位置，经无菌水冲洗3遍后放入1.5mLEP管中，用菌枪头捣碎，加入30ul ddH2O浸泡5小时。将EP管12000rpm离心5min，取上清作为PCR模板，在不带GC夹子的针对18S rDNA片段设计的特异引物NS31：5‘-TGGAGGGCAAGTCTGGTGCC-3’；下游引物Glol：5′-GCCTGCTTTAAACACTCTA-3′的引导下，进行PCR扩增，50ul PCR反应体系为：10ng的DNA模板(一般用1μl)、50pmol每种引物、1μl dNTPs、5μl的10×PCRbuffer、2.5mmol/L的MgCl2、3U的Taq DNA聚合酶，适量的双蒸水补足50μl。采用巢式PCR反应程序：94℃预变性4min，然后在94℃变性45s，50℃引物复性45s，72℃引物延伸1.5min，循环30次，72℃终延伸10min；反应结束后取3ul反应产物进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，用CyCle-Pure DNA试剂盒对目的片段进行回收及纯化，并进行测序。测序由天津生物芯片公司进行。[0082] 采用Blast程序在线(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)进行序列比对分析，分析结果见表2
[0083] [0084]
表2 酱香大曲生产过程中及不同质量成品曲的DGGE指纹图谱对应单个条带的序列比对分析
DGGE条带1
相似序列
相似菌株
相似度
EF209902.1
Phryganophilus ruficollis100％voucher
Saccharomyces sp.Saccharomyces sp.Saccharomycopsis
100％99％100％
234
DQ345283.3DQ345283.2
EU057520.1
fibuligera strain
5
EU410422.1
Rhizopus microsporusvar.
Penicillium sp.Absidia corymbiferastrain
99％
67
FJ430775.1AF113408.1
100％100％
11
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说 明 书
EU710834.1
Mucor sp.
99％
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[0085]
为了满足高温大曲所特有的复杂微生物种类，准确地分离出优势菌群，通过反复实验，得出制备聚丙烯酰胺变性梯度凝胶的变性梯度为35％～60％，使用的电泳缓冲液为0.5-l×TAE，上样量为200ng，电压80-120V，60℃，电泳8-12h，溴化乙锭染色20-30min，可得出清晰准确的DGGE图谱。(见图3)[0086] 二、细菌DNA[0087] 1、准备样品
[0088] 对贵州茅台镇金士酒业有限公司酱香白酒大曲生产车间生产的大曲进行取样，在制曲过程中按一个周期中的不同时间取样，本实验用的酱香高温大曲样品是在贵州茅台镇金士酒业有限公司大曲生产车间取样。[0089] 2、总DNA的提取及纯化
[0090] 称取5g样品置50ml的三角瓶中，加13.5mL DNA的extraction buffer，加20mg/mL的蛋白酶K100ul，25mg/mL的溶菌酶1ml，37℃，225rpm，水平摇动30min，摇完后加入4.5ml 10％的SDS(加量是总体积的3％)，65℃水浴保育2h，每15-20min，缓慢摇动一次，尽量打散，然后8000转室温离心10min，收集上清液，转到50ml离心管中，加入相同体积的氯仿，离心收集水相，加0.6倍体积的异丙醇，-20℃沉淀过夜，然后12000转4℃离心20min，收集沉淀，用70％冷乙醇冲洗(洗后离心才能去上清液)，吹干，用1×TE悬浮，定容到20-40ul。
[0091] 基因组DNA的纯化方法为采用美国OMEGA BIO-TEK公司生产的PCR产物纯化试剂盒，按照用户使用说明来进行。[0092] 3、PCR扩增及产物回收、纯化
[0093] 对纯化后的DNA进行PCR扩增，第一步扩增采用的引物为8-27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1378-1401R：5′-TACCTTGTTACGACTT-3′。第二步扩增采用的引物为：968FGC：5’-CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGG GCGGGG GCA CGG GGG GAA CGC GAA GAA CCT TAC-3’和R1041：5’-CGGTGTGTACAAGACCC-3’，以上引物全部由上海生工生物工程技术有限公司合成。先加入扩增16S rDNA全长的引物和反应体系进行第一步扩增，50μl的PCR反应体系组成如下：10ng的DNA模板(一般用1μl)、50pmol每种引物、1μl dNTPs、5μl的10×PCRbuffer、2.5mmol/L的MgCl2、3U的Taq DNA聚合酶，适量的双蒸水补足50μl。PCR反应条件为：94℃预变性4min，然后在94℃变性45s，50℃引物复性45s，72℃引物延伸1.5min，循环30次，72℃终延伸10min；取其产物进行100倍稀释后作为模板，以16S rDNA V3可变区为目标进行扩增，PCR反应条件为：94℃预变性4min，然后在94℃变性45s，55℃引物复性45s，72℃引物延伸1min，循环35次，72℃终延伸10min，16S rDNA全长序列扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测；取其产物进行100倍稀释后作为模板，以16S rDNA V3可变区为目标进行扩增，PCR反应条件为：94℃预变性4min，然后在94℃变性45s，55℃引物复性45s，72℃引物延伸1min，循环35次，72℃终延伸10min，目的产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测。电泳缓冲液为1×TAE缓冲液。[0094] 取全部样品进行2％琼脂糖凝胶电泳(80V，50min)，在紫外灯下切胶回收230bp的目的条带，用CyCle-Pure DNA纯化试剂盒并按照试剂盒说明书对目的片段进行纯化，纯化
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后取3ul纯化产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果表明获得了纯度较高的目的片段。
[0095] 4、变性梯度凝胶电泳(DGGE)及凝胶成像扫描与分析
TM
[0096] 采用DCODE系统(BIO-RAD)构建DGGE指纹图谱，具体方法为：将等量的步骤三获得的样品的16S v3区扩增纯化产物(约230bp)混合，取200ng用10％变性聚丙烯酞胺凝胶电泳进行分离(丙烯酞胺浓度0-100％，电泳缓冲液0.5 x TAE，80V，16h)，然后切下目的泳道区域，用E.B对变性聚丙烯酞胺凝胶染色，用Vilber凝胶成像扫描系统对银染条带进行照像，结果如图1所示，对图1进行分析，确定适宜的DGGE丙烯酞胺浓度范围为35％-60％。再取混合DNA样品，按100ng点样量、200ng点样量(3个平行)及300ng点样量在上述丙烯酞胺适宜的浓度范围内用10％变性聚丙烯酞胺凝胶电泳进行分离，其余操作同上。在Vilber凝胶成像扫描系统中对银染条带进行照像，结果显示100ng点样量的泳道损失2条条带，200ng点样量与300ng点样量所得到的指纹图谱一致，并且200ng点样量3个平行样的指纹图谱完全一样，表明DGGE技术具有可重复性。取相同的点样量200ng，做DGGE谱图，找出最佳电泳时间，见图2，图中可以看出10h时，条带最清晰，因此选用DGGE时间为10h。[0097] 上述预试结果表明，将各样品16S rDNAv3区扩增纯化产物在10％聚丙烯变性胶中分离(丙烯酞胺浓度35％-60％，电泳缓冲液0.5-1 x TAE)，100V，12h，样品点样量200ng DNA(重复I)、另设一组点样量1000ng DNA(重复II)。[0098] 将重复I所在泳道区域切下，用快E.B染法对其进行染色。在vilber凝胶成像扫描系统中对染色条带进行照像，照相结果及其模式图如图3所示，用BiO-ID++软件对该DGG时旨纹图谱进行半定量分析，确定高温大曲生产过程中菌群结构的关系及各个条带所代表细菌群在全部优势菌群的比例，即相对丰度，相对丰度Pi(％)＝100 x ODi/OD[0099] 其中ODi为选定条带i的光密度，OD为全部条带光密度之和。
[0100] 表3 16SrDNA V3区扩增纯化产物DGGE指纹图谱中酱香高温大曲细菌优势菌群相对丰度(％)
[0101] 条带位置 出仓曲 入仓曲 母曲，一次翻曲 二次翻曲[0102] 1 5.5 -- 6.5 -- 8.5[0103] 2 9.5 5.5 9.5 -- 9.5[0104] 3 -- 5.5 -- -- 6.5[0105] 4 -- -- -- 5.0 --[0106] [0107] [0108] [0109] [0110] [0111] [0112] [0113] [0114] [0115]
5 -- -- -- 6.7 --6 -- -- -- 6.0 --7 -- -- -- 6.5 --8 7.8 -- 7.6 -- --9 5.6 -- 5.0 -- --10 -- -- 6.0 -- --11 -- 6.7 -- -- --将重复II所在泳道区域切下，按E.B染色。5、优势条带的回收、测序与序列比对分析
在紫外灯下将重复II所在泳道的明显条带用无菌手术刀小心割下，并在银染
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图谱中标记相应位置，经无菌水冲洗3遍后放入1.5mLEP管中，用菌枪头捣碎，加入30ul ddH2O浸泡5小时。将EP管12000rpm离心5min，取上清作为PCR模板，在不带GC夹子的针对16S rDNA v3区片段设计的特异引物968F5’-AA CGC GAA GAA CCTTAC-3’和R1041：5’-CGGTGTGTACAAGACCC-3’的引导下，进行PCR扩增，50ulPCR反应体系为：10ng的DNA模板(一般用1μl)、50pmol每种引物、1μl dNTPs、5μl的10×PCR buffer、2.5mmol/L的MgCl2、3U的Taq DNA聚合酶，适量的双蒸水补足50μl。采用巢式PCR反应程序：94℃预变性4min，然后在94℃变性45s，50℃引物复性45s，72℃引物延伸1.5min，循环30次，72℃终延伸10min；反应结束后取3pl反应产物进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，用CyCle-Pure DNA试剂盒对目的片段进行回收及纯化，并进行测序。测序由天津生物芯片公司进行。采用Blast程序在线(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)进行序列比对分析，分析结果见表2[0116] 表4 酱香大曲生产过程中细菌DGGE指纹图谱对应单个条带的序列比对分析
[0117]
DGGE band 1
Accession number Closest identity ％identity
AJ535638.1
Bacillus
galactosidilyticus Uncultured bacterium Virgibacillus sp. Bacillus sp. Thermoactinomyces sp.
Bacillus sp. Virgibacillus sp. Bacillus sp. Bacillus sp. Bacillus sp. Salibacillus sp.
99
2 3 4 5
AB269425.1 AY422988.1 AB211017.1 DQ225173.1
100 99 100 100
6 7 8 9 10 11
[0118]
EU161045.1 AY422968.1 AB211027.1 EU162045.1 AB201027.1 AY762976.1
100 99 100 100 99 99
为了满足高温大曲所特有的复杂微生物种类，准确地分离出优势菌群，通过反复
实验，得出制备聚丙烯酰胺变性梯度凝胶的变性梯度为35％～60％，使用的电泳缓冲液为0.5-l×TAE，上样量为200ng，电压80-120V，60℃，电泳8-12h，溴化乙锭染色20-30min，可得出清晰准确的DGGE图谱。
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说 明 书
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实施例2，对酱香高温大曲中成品曲细菌和真菌的优势菌群的分析，所用方法与实施例1相同，得到的谱图如图5，序列比对分析见表3
[0120] 表3 成品曲分析的DGGE指纹图谱对应单个条带的序列比对分析
[0121]
DGGE band 1
Accession number Closest identity ％identity
AJ535638.1
Bacillus
galactosidilyticus Uncultured bacterium Virgibacillus sp. Bacillus sp. Thermoactinomyces sp.
Bacillus sp.
99
2 3 4 5
AB269425.1 AY422988.1 AB211027.1 DQ225173.1
100 99 100 100
6
[0122]
EU162045.1 100
可以看出酱香白酒成品大曲中细菌的优势菌群是：Uncultured bacterium，
Virgibacillus sp.，Bacillus sp.和Thermoactinomyces sp.。
[0124] 同样得到酱香白酒成品大曲中真菌的优势菌群是：Saccharomyces sp.，Saccharomycopsisfibuligera strain和Mucor sp.。[0125] 实施例3，取未知的大曲样品作为盲样进行测定，所用方法与实施例1相同，得到的谱图如图6
[0126] 图谱中可以看出，样品H和T谱图相近，是成品的酱香白酒大曲与实际相符，其优势菌群，细菌是：Uncultured bacterium，Virgibacillus sp.，Bacillus sp.和Thermoactinomyces sp.。
[0127] 样品L真菌的优势菌群是：Saccharomyces sp.，Saccharomycopsis fibuligera strain和Mucor sp.与实际相符。
[0123]
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说 明 书 附 图
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图1
图2
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说 明 书 附 图
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图3
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说 明 书 附 图
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图4
图5
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说 明 书 附 图
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图6
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