江苏农业科学２０１１年第３９卷第６期 陈俏彪，王东明，毛可红．食用菌培养料细菌性污染的细菌种群特征［Ｊ］．江苏农业科学，２０１１，３９（６）：４１７—４１８ 食用菌培养料细菌性污染的细菌种群特征 陈俏彪，王东明，毛可红 （丽水职业技术学院环境工程分院，浙江丽水３２３０００） 摘要：从细菌性污染的黑木耳及香菇袋中分离出分属枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、黄海芽孢杆菌等的５个细 菌菌株，其中４个为芽孢杆菌。镜检观察表明，４种芽孢杆菌的菌体、芽孢形态均有一定差异，另１个菌株不能形成芽 孢，说明引起香菇袋污染的细菌种类不同。非芽孢细菌在高压和常压下均可灭菌失活，污染袋中的非芽孢细菌污染可 能是由于接种等操作污染引起的。在常压下灭菌，不同芽孢菌存活率不同，生产中常压灭菌后，就可能有部分芽孢存 活下来，造成培养料细菌性污染。 关键词：食用菌；细菌；芽孢；芽孢杆菌 中图分类号：Ｓ４３６．４６ １ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２—１３０２（２０１１）０６—０４１７—０２ 食用菌栽培常压灭菌是将料温升至１００℃后保持１２ ｈ， １．２．３菌体扩增及计数１５０ ｍＬ三角瓶装入４０ ｍＬ液体培 这样即可彻底灭菌。但是这样的灭菌温度和时间虽能杀灭绝 养基，高压灭菌后，接种１０ ＣＦＵ／ｍＬ菌悬液１ ｍＬ，３０℃培养 大多数真菌和细菌，却不能杀死细菌芽孢。由于灭菌后耐高 ４８—７２ ｈ，转速１７０ ｒ／ｍｉｎ。培养过程中取１ ｍＬ培养液，稀释 温的细菌芽孢仍然存在，随着培养料的冷却，芽孢很快萌发， １Ｏ～１Ｏ 倍，血球计数板计数。 在食用菌菌丝发满全袋前，早已有细菌孳生。细菌危害往往 １．２．４菌体回接培养料将分离的５个菌株液体培养液稀 造成培养料的酸化，抑制食用菌菌丝的生长，弱化各种分解酶 释为０．１×１０ ＣＦＵ／ｍＬ的菌悬液，用菌悬液拌培养料，以手 和合成酶的功能，从而影响菌丝营养吸收和原生质体的合成， 握成团、无水滴滴下为宜。培养料采用高压（１２１℃）灭菌 最终影响食用菌产量与品质。本研究分析造成食用菌培养料 ２０ ｍｉｎ、常压（１００℃）灭菌１２ ｈ等２种灭菌方式。灭菌后，菌 细菌性污染的菌体类别，以及在高压、常压灭菌条件下各类细 袋室温下放置５ ｄ。分别取１０ ｇ培养料稀释１０—１０ 倍，涂平 菌的变化规律，为食用菌栽培提供参考。 板，３０℃培养３ ｄ，显微观察菌体特征，计算５个菌株在不同 １材料与方法 灭菌条件下的菌体存活量。 １．２．５ １６Ｓ ｒＤＮＡ鉴定菌种 １．１材料 １．２．５．１ ＰＣＲ反应扩增１６Ｓ ｒＤＮＡ按细菌基因组ＤＮＡ抽 １．１．１试剂与材料试剂与材料包括牛肉膏、蛋白胨、氯化 提试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）所述方法提取基 钠、琼脂、结晶紫、木屑、麸皮、白糖、石灰等。供试细菌污染黑 因组ＤＮＡ，保存于一２０℃冰箱供ＰＣＲ使用。细菌１６Ｓ ｒＲＮＡ 木耳及香菇袋包括来自北京房山香菇污染袋２袋（代号房山 序列扩增采用１６Ｓ ｒＮＤＡ通用引物，２７Ｆ：５，＿ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣ（ １、房山２）、龙泉黑木耳污染袋１袋（代号）及丽水职业技术学 Ｃ／Ａ）ＴＧＧＣＴＣＡＧ一３ ；１４９２Ｒ：５ 一ＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ 院食用菌生产基地黑木耳污染袋２袋（代号校内１、校内２）。 一３ 。ＰＣＲ扩增产物经琼脂糖凝胶电泳（电泳强度为 １．１．２仪器奥林巴斯ＢＸ５１显微镜、恒温振荡培养器等。 ５ Ｖ／ｃｍ）检测后，利用试剂盒胶回收ＰＣＲ产物，交测序公司测 １．１．３ 培养基食用菌栽培培养料配方：木屑７６％、麸皮 定序列 。 ２０％、石膏１．５％、过磷酸钙１．５％、蔗糖１％＿１ ；试管斜面培 １．２．５．２ １６Ｓ ｒＤＮＡ序列分析序列同源性用ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎ－ 养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基；菌体扩增培养基：牛肉膏蛋 ａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｌ￣ｏｒｍａｔｉｏｎ）数据库中的Ｂｌａｓｔ工具 白胨液体培养基。 进行比较，并利用ＤＮＡＳｔａｒ软件绘制进化树。 １．２方法 １．２．Ｉ污染袋中的细菌分离取样１０ ｇ，制成１０—１０ 倍稀 ２结果与分析 释液，取１０ 一１０。倍稀释液０．１ ｍＬ涂平板，３０℃培养３６ ｈ； ２．１ 香菇袋中细茵性污染的细菌类别 另取样１０ ｇ，先８０℃低温灭菌２０ ｍｉｎ，然后制成１０～１０ 倍 从２个龙泉污染袋分离得到２个菌株，分别编号为菌株 稀释液，取１０ ～１０。倍稀释液０．１ ｍＬ涂平板，３Ｏ℃培养 １、菌株２；从北京房山污染袋分离得到１个菌株，编号为菌株 ３６ ｈ［ 。 ３；从校内生产基地污染袋分离得到２个菌株，分别编号为菌 １．２．２菌体形态观察采用结晶紫单染法 ］。 株４、菌株５。 菌株１、菌株３、菌株４、菌株５菌落较干燥，白色；菌株２ 收稿日期：２０１１—０９—０５ 菌落湿润，乳白色。菌株１菌体短粗，芽孢大，芽孢数目多，形 基金项目：浙江省丽水市校企科技合作项目。 成能力强；菌株２为短小杆菌，不能形成芽孢；菌株３的芽孢 作者简介：陈俏彪（１９６３一），男，浙江永康人，研究员，从事食用菌教 近球形；菌株４有部分正在形成芽孢的菌体，菌体染色不均， 学及技术研究。Ｅ—ｍａｉｌ：７７５８８５７７＠ｑｑ．ｃｏｍ。 芽孢较大；菌株５类似菌株１，但芽孢较菌株１略小（图１）。 ４１８～ 江苏农业科学２０１１年第３９卷第６期 菌株１ 菌株２ 菌株３ 菌株４ 菌株５ 围Ｉ 食用菌污染袋分离的不同菌株菌体显微特征 从不同来源污染香菇袋分离出的细菌有一定的差异（表 ２．３茵体回接培养料 １），观察结果表明，造成香菇袋污染的细菌主要为芽孢杆菌。 生产上目前常采用常压（１００ ｏｃ）灭菌１２ ｈ，由于芽孢耐热力 强，部分芽孢并未被灭活，条件适宜时萌发，造成细菌性污染， 抑制食用菌菌丝的正常生长。 表１ 不同来源食用菌污染袋１００℃灭菌前后菌数的变化 ２．２菌体扩增 对菌株１、菌株２、菌株３、菌株４、菌株５分别进行菌体扩 增。液体培养条件下，培养６ ｈ，培养液清澈，茵体并未增殖， 菌体生长处于潜伏期；培养９ ｈ，菌株１、菌株４培养液变浑 浊，菌体生长进入对数期；培养１８ ｈ，菌株５培养液才开始变 为浑浊，潜伏期较长；培养２４ ｈ后，菌株４、菌株５开始形成芽 孢，菌株３开始衰老死亡，菌株１、菌株３依然在进行增殖；培 养４８ ｈ，菌株ｌ、菌株３形成芽孢，停止增殖（图２）。 一菌株ｌ一菌株２一菌株３—一菌株４—一菌株５ —４．０ ｂ ２．５ ２．０ ＝１．５ 衄１ １．０ 掘０．５ ０ ６ ９ １２ １５ ｌ８ ２４ ４８ 培养时间（ｈ） 圈２ 不同分离菌株的菌体扩增液体培养生长曲线 表２回接后高压灭菌、常压灭菌后菌体数量 不同灭菌方式培养料中细菌数（ＣＦＵ／ｇ） 菌株 常压灭菌（个／ｇ） 高压灭菌（个／ｇ） 分别将菌株１、菌株２、菌株３、菌株４、菌株５的０．１×１０ ＣＦＵ／ｍＬ菌悬液回接培养料，经高温（１２１℃）灭菌后，培养料 中所有微生物被彻底杀灭。菌株２在常压灭菌下也被灭活， 菌株２在污染袋中出现则可能是由于接种时操作污染所引 起。菌株１、菌株３、菌株４、菌株５回接后在常压灭菌下均有 部分芽孢存活下来，存活的菌体数量有一定差异（表２），与芽 孢菌抗热能力、分散度及芽孢形成率有关。生产中当培养料 受某种芽孢菌污染后，由于芽孢菌数量多，常温灭菌后，就有 可能部分芽孢菌存活下来，造成培养料细菌性污染。 ２．４菌株鉴定 获得芽孢菌１６Ｓ ｒＤＮＡ基因序列后，提交ＮＣＢＩ进行Ｂｌａｓｔ 分析，比对结果分别是：菌株１与检索号为ＪＦ４９５１０５的枯草 芽孢杆菌Ｂａｃ／／／ｓｕ ｓｕｂｔｉｌｉｓ菌株ＢＳＰ１ ｌ １６Ｓ ｒＲＮＡ基因同源序列 有９９％的相似性；菌株３与检索号为ＨＱ２０２５４９的枯草芽孢 杆菌菌株ＲＨＨ５７ １６Ｓ ｒＲＮＡ基因同源序列有１００％的相似性； 菌株４与检索号为ＨＭ７７００９８的苏云金芽孢杆菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ菌株ＯＤＰＹ １６Ｓ ｒＲＮＡ基因同源序列有９９％的相 似性；菌株５与检索号为ＡＢ６１７５５１的黄海芽孢杆菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｒｉｓｌｆａｖｉ １６Ｓ ｒＲＮＡ基因同源序列有９９％的相似性。因此， 本试验从食用菌污染袋培养料中分离的菌株１、菌株３、菌株 ４、菌株５分别鉴定为Ｂａｃｉｌｌｓｕ ｓｕｂｔｉｌｉｓ菌株ＢＳＰ１ １、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂ． ｔｉｌｌｓ菌株ＲＨＨ５７、Ｂａｃｉｌｌｓｕ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ菌株ＯＤＰＹ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｒｉｓｌｆａｖｉｏ ３小结 本研究从不同细菌污染香菇袋中分离出５种细菌，其中 ４种为芽孢杆菌，１种为不能产生芽孢的细菌。说明污染香菇 袋的细菌种类是有一定差异的，以芽孢杆菌性污染居多。非 芽孢细菌在常压下即可灭菌失活，污染袋中出现非芽孢细菌 污染可能是由于接种等操作引起的。在常压下灭菌，不同芽 孢菌存活率不同，生产中常压灭菌后，就有可能部分芽孢菌存 活下来，造成培养料细菌性污染。 参考文献： ［１］常明昌．食用菌栽培［Ｍ］．北京：中国农业出版社，２００９：２７１． ［２］沈萍．微生物学实验［Ｍ］．北京：高等教育出版社，１９９９：２６— ２８。 ［３］Ｍａｒｔｉｎ Ｆ Ｐ，Ｃｏｌｌｅｎ Ｍ Ｃ．Ｂｉａｓ ｉｎ ｔｅｍｐｌａｔｅ ｔｏ ｐｒｏｄｕｃｔ ｒａｔｉｏｓ ｉｎ ｍｕｌｔｉ・ ｔｅｍｐｌａｔｅ ＰＣＲ［Ｊ］．Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９８，６４（１Ｏ）：３７２４— ３７３０．
