*CN102666843A*
(10)申请公布号 CN 102666843 A(43)申请公布日 2012.09.12
(12)发明专利申请
(21)申请号 201080058385.7(22)申请日 2010.12.20(30)优先权数据
61/288,836 2009.12.21 US(85)PCT申请进入国家阶段日 2012.06.21
(86)PCT申请的申请数据
PCT/US2010/061320 2010.12.20(87)PCT申请的公布数据
WO2011/079073 EN 2011.06.30(71)申请人布里格海姆妇女医院公司
地址美国马萨诸塞(72)发明人F·姚
(74)专利代理机构中国国际贸易促进委员会专
利商标事务所 11038
代理人罗菊华(51)Int.Cl.
A61K 39/395(2006.01)A61K 39/245(2006.01)A61K 38/16(2006.01)
C12N 7/04(2006.01)
(54)发明名称
单纯疱疹病毒疫苗(57)摘要
本发明涉及可用于免疫患者以抵抗生殖器疱疹的疫苗中的单纯疱疹病毒2型。
权利要求书 2 页 说明书 16 页权利要求书2页 说明书16页
序列表 2 页 附图 6 页序列表2页 附图6页
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权 利 要 求 书
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1.一种复制缺陷型、显性-阴性单纯疱疹病毒2型(HSV-2)重组病毒，其在其基因组内包含：
a)编码第一HSV-2糖蛋白D(gD2)的第一序列，其中所述序列可操作地连接至第一启动子，并且所述第一启动子可操作地连接至第一四环素操纵子(Tet-O)序列;
b)任选地，编码第二HSV-2 gD2的第二序列，其中所述第二序列可操作地连接至第二启动子，并且所述第二启动子可操作地连接至第二tet-O序列;
c)编码HSV-1或HSV-2 UL9蛋白的第一显性阴性突变体形式的第三序列，其中所述第三序列可操作地连接至第三启动子，并且所述第三启动子可操作地连接至第三四环素操纵子(tet-O)序列;
d)任选地，编码HSV-1或HSV-2 UL9蛋白的第二显性阴性突变体形式的第四序列，其中所述第四序列可操作地连接至第四启动子，并且所述第四启动子可操作地连接至第四四环素操纵子(tet-O)序列;
并且其中所述基因组不包含编码功能性ICP0蛋白的序列。2.权利要求1的重组病毒，其中所述重组病毒在其基因组内包含编码第二HSV-2 gD2的所述第二序列，其中所述第二序列可操作地连接至第二启动子，并且所述第二启动子可操作地连接至第二tet-O序列。
3.权利要求2的重组病毒，其中所述重组病毒在其基因组内包含编码HSV-1或HSV-2 UL9蛋白的第二显性阴性突变体形式的所述第四序列，其中所述第四序列可操作地连接至第四启动子，并且所述第四启动子可操作地连接至第四四环素操纵子(tet-O)序列。
4.权利要求1-3中任一项的重组病毒，其中所述第一、第二、第三和第四启动子的一个或多个为hCMV立即早期启动子。
5.权利要求1-3中任一项的重组病毒，其中所述第一、第二、第三和第四启动子的一个或多个为HSV-1或HSV-2立即早期启动子。
6.权利要求5的重组病毒，其中所述HSV-1或HSV-2立即早期启动子为ICP4。7.权利要求5的重组病毒，其中所述第一、第二、第三和第四启动子全部为HSV-1或HSV-2立即早期启动子。
8.权利要求5的重组病毒，其中所述第一、第二、第三和第四启动子为ICP4启动子。9.利要求1-3中任一项的重组病毒，其中:a)所述第一、第二、第三和第四启动子各自具有TATA元件;b)所述第一、第二、第三和第四Tet-O序列的每一个包含两个通过2-20个连接核苷酸连接的op2阻遏物结合位点，其中所述tet操纵子中的第一核苷酸位于所述TATA元件的最后一个核苷酸的3'端的6至24个核苷酸之间;
c)编码HSV-2gD2的所述序列和编码HSV-2gD2的所述第二序列位于所述第一和第二Tet-O序列的3'端，并且可操作地连接至所述第一和第二启动子;
d)编码HSV-1或HSV-2UL9蛋白的所述第一显性阴性突变体形式的所述序列位于所述第三Tet-O序列的3'端，并且可操作地连接至所述第三启动子；
e)编码HSV-1或HSV-2UL9蛋白的所述第二显性阴性突变体形式的所述序列位于所述第四Tet-O序列的3'端，并且可操作地连接至所述第四启动子。
10.权利要求1-9中任一项的重组病毒，其中所述UL9蛋白的突变体形式为
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UL9-C535C。
11.权利要求1-10中任一项的重组病毒，其中所述重组病毒还表达一个或多个重组免疫调节基因。
12.权利要求11的任一项的重组病毒，其中所述重组病毒表达IL12。13.权利要求11的任一项的重组病毒，其中所述重组病毒表达IL15。14.权利要求1-13中任一项的重组病毒，其中所述重组病毒还表达处于具有te tO的HSV或hCMV立即早期启动子的控制之下的HSV-2gB。
15.权利要求1-14中任一项的重组病毒，其中所述重组病毒还表达处于具有tetO的HSV或hCMV立即早期启动子的控制之下的HSV-2gC。
16.一种以单位剂量形式包含权利要求1-15中任一项的重组病毒的疫苗。17.权利要求16的疫苗，其中所述重组病毒以最低1x 107pfu/单位剂量存在。18.权利要求16的疫苗，其中所述重组病毒以1x 107-1x 109pfu/单位剂量存在。19.免疫患者以抵抗HSV-1或HSV-2感染的方法，其包括给所述患者施用权利要求16-18中任一项的疫苗。
20.权利要求19的方法，其中所述患者对于HSV-1呈血清阳性。21.权利要求19的方法，其中所述患者对于HSV-2呈血清阳性。22.权利要求19的方法，其中所述患者对于HSV-1和HSV-2二者都呈血清阳性。23.权利要求19的方法，其中所述个体对于HSV-1和HSV-2感染都呈血清阴性。
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说 明 书单纯疱疹病毒疫苗
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交叉参考相关申请
[0002] 本申请要求2009年12月21日提交的美国临时申请61/288,836的优先权和权益。该在先申请通过引用整体并入本文。
[0001]
发明领域
本申请主要涉及可用于免疫患者以抵抗与慢性生殖器溃疡相关的单纯疱疹病毒2
型(HSV-2)感染的疫苗。疫苗利用已被工程改造以表达高水平HSV-2糖蛋白D抗原(gD2)的复制缺陷型HSV-2病毒。在优选实施方案中，所述HSV-2病毒还表达一种或多种免疫调节基因，例如IL15和/或HSV-1或HSV-2主要抗原例如gB或gC。[0004] 发明背景
[0005] 单纯疱疹病毒(HSV)和HSV感染
[0006] 单纯疱疹病毒2型(HSV-2)是生殖器溃疡疾病的首要原因。其可引起急性生产性感染和特征在于不可预测的周期性流行的长期潜伏感染(66)。除了引起终生复发性生殖器溃疡外，HSV感染还是AIDS患者的主要担忧。已证明，生殖器HSV-2感染使性行为感染HIV感染(sexuallyacquiring HIV infection)的风险增加至3倍(20)，并且在亚洲，该风险的增加可促成25-35%的伴随性HIV感染(incident HIV infection)(1)。
[0007] 虽然大多数具有症状的HSV原发感染的严重度和持续时间可通过利用阿昔洛韦、伐昔洛韦或泛昔洛韦的口服或静脉内治疗减轻，但抗病毒疗法既不能防止从原发感染建立潜伏感染，也不能减少随后的复发(66)。过去20年中生殖器疱疹在美国的持续传播(19)和抗现有抗病毒药物的HSV的递增的发病率表明，需要抗HSV感染的安全有效的疫苗(31，60)。此外，HSV抑制疗法导致感染了HSV-2和HIV的妇女的生殖器粘膜和血浆中的HIV水平显著降低的发现(52)表明，有效的HSV疫苗还可对HIV感染的控制具有重大影响(1，31)。[0008] HSV-2糖蛋白D(gD2)
[0009] HSV糖蛋白D(gD)是在感染的细胞的表面(21)以及病毒包膜(24)上表达的最主要的病毒抗原之一。gD是病毒进入细胞所必需的并且是抗HSV感染的中和抗体的主要靶(12、49、53)。此外，gD是HSV感染的人和鼠模型中的CD4+T细胞(包括CD4+T细胞的细胞毒性)和CD8+T细胞的主要病毒靶(27,28,30,34,47,65,75)。由于这些原因，gD已成为HSV亚单位疫苗开发的主要焦点(32，60)。[0010] 在第3期临床试验中，Stanberry等人显示，利用来自HSV-2的重组gD(gD2)与佐剂AS04的组合的接种在保护HSV-血清阴性妇女免受生殖器疱疹疾病的发展中提供了73-74%的功效(62)。然而在男性和对于HSV-1呈血清阳性的受试者中未观察到显著的功效。虽然在免疫的宿主中检测到gD2特异性体液和CD4+T细胞应答，但还不清楚gD2/AS04在引发CD8+T细胞应答中是否有效(31，32)。该研究表明，存在对引发针对gD2和其它HSV病毒抗原的更广泛的体液以及CD4和CD8T细胞应答的HSV疫苗的需要(29,31,32)。[0011] 病毒疫苗
[0012] 已有不少文献报道，能够在宿主中从头合成免疫原的活病毒疫苗诱导比仅由肽或
[0003]
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说 明 书
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蛋白质组成的疫苗更广和更持久的免疫应答。已开发了多种形式的复制缺陷型HSV和神经减毒的(neuroattenuated)、具有复制能力的突变体，并且经测试它们具有作为抗HSV感染的疫苗的潜能(US 7,223,411;(18))。
[0013] 因为复制缺陷型病毒和神经减毒的突变体可与野生型病毒一起共复制或在野生型病毒的背景中变得具有复制能力，因此它们用作人疫苗的用途导致了安全问题，特别是在具有潜伏HSV感染的个体中(33)。复制缺陷型HSV-1突变体可使啮齿类动物脑中的潜伏HSV-1立即早期启动子再活化的观察结果已引起了关于下述可能性的另外的安全问题：此类重组体触发潜伏感染的个体中的生产性病毒感染的爆发的可能性(63)。因此，理想的复制缺陷型重组HSV疫苗不仅应当具有表达广谱的病毒编码的抗原的能力，而且还应当编码当在相同细胞内遭遇时可阻止野生型HSV的裂解性感染的独特功能。这样的安全机制可使通过疫苗载体与野生型病毒在宿主中的重组引起的疫苗病毒的潜在爆发降至最低水平。[0014] 发明概述[0015] 一般而言，本发明基于四环素基因开关技术(tetracycline gene-switch technology)(T-REx,Invitrogen)(73)和HSV-1UL9多肽的显性阴性突变体形式(例如UL9-C535C)用于开发抗HSV-2感染的安全有效的重组病毒疫苗的用途。[0016] 在其第一方面，本发明涉及复制缺陷型、显性阴性单纯疱疹病毒2(HSV-2)重组病毒。所述病毒的基因组至少具有，可操作地连接至第一启动子的编码第一HSV-2糖蛋白D(gD2)的第一序列和，优选地，可操作地连接至第二启动子的编码第二HSV-2gD2的第二序列。将启动子分别可操作地连接至第一四环素操纵子(tet-O)序列和第二tet-O序列，当不存在tet阻遏物时，所述操纵子序列各自允许进行转录，但当被阻遏物结合时，所述操纵子序列各自阻断转录。基因组还包括连接至第三启动子的编码至少HSV-1或HSV-2UL9蛋白的第一显性阴性突变体形式的第三序列和，优选地，连接至第四启动子的编码HSV-1或HSV-2UL9蛋白的第二显性阴性形式的第四序列。与第一和第二启动子一样，第三和第四启动子各自可操作地连接至tet-O序列，其如果被tet阻遏物结合则阻断转录。此外，病毒的基因组的特征在于，编码功能性ICP0蛋白的序列的不存在。为了增强其抗原性，基因组应当优选还表达免疫调节基因，例如IL12或IL15和/或HSV-1或HSV-2主要抗原例如gB或gC。
[0017] 术语“可操作地连接”是指，以使它们能够进行它们的正常功能的方式连接在一起的基因元件。例如，当基因的转录处于启动子的控制之下并且该转录导致由所述基因正常编码的产物产生时，所述基因可操作地连接至启动子。当操纵子在结合的tet阻遏物存在的情况下阻断从启动子的转录，但在所述阻遏物不存在的情况下允许转录时，tet操纵子序列可操作地连接至启动子。术语“重组体”是指具有核酸序列的病毒，所述核酸序列有时通过核酸序列和序列元件的重组以及这些重组序列至病毒或至祖先病毒中的引入形成。[0018] 优选，所使用的启动子是具有TATA元件的启动子，并且连接至启动子的tet操纵子序列具有两个通过2至20个连接核苷酸连接在一起的op2阻遏物结合位点。操纵子序列的定位对于实现启动子的有效控制是非常重要的。特别地，操纵子序列中的第一核苷酸必须位于TATA元件的最后一个核苷酸的3'端的6至24个核苷酸之间。编码例如gD或UL9的显性阴性突变体多肽的结构序列位于操纵子的3'端。其中特别优选的启动子为hCMV立即早期启动子和HSV-1或HSV-2立即早期启动子。特别优选的是HSV-1或HSV-2ICP4启动
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在另一个方面，本发明涉及可用于预防性或治疗性抗HSV表达并且以单位剂量形
式包含一种或多种上述重组病毒的疫苗。术语“单位剂量形式”是指单个药物施用实体例如片剂或胶囊。优选，“单位剂量形式”可以是溶液，其中以这样的浓度将药物溶解在所述溶液中，当通过注射给患者施用选择的体积(单位剂量)并且所述体积见于注射瓶时，所述
[0019]
浓度提供治疗性或预防性效果。基于小鼠中使用的有效剂量(2x 106PFU)，据信人中的最小有效剂量应当为约1x 107pfu。因此，单位剂量应当具有至少该量的病毒，通常为1x 107-1x 109pfu。可将疫苗以冻干的形式贮存并且在施用之前于药学上可接受的载体中重建。或者，可将制剂本身贮存在媒介物中。单个剂量的疫苗的体积可发生变化，但一般说来，应当为约0.1ml至10ml，更常见地约0.2ml至5ml。[0020] 本发明还包括，通过给患者施用上述疫苗来免疫患者以抗HSV-1或HSV-2感染和由这样的感染引起的病况(例如，生殖器疱疹溃疡)的方法。还可给已被感染的患者提供疫苗，以防止或减少病毒的爆发。用于给患者施用疫苗且不导致病毒的破坏的任何方法与本发明相容。通常，可通过胃肠外方法例如通过肌内或静脉内注射进行施用。可使用本领域的常规方法来确定疫苗施用的剂量和时间安排。可以以单次或多次注射施用制剂。[0021] 附图概述
[0022] 图1A和1B:图1A显示用于构建显性阴性和复制缺陷型HSV-2重组N2-C535C和CJ2-gD2的质粒的示意图。质粒pHSV-2/ICP0是包含覆盖HSV-2 ICP0开放阅读框架(灰色框)的上游268bp至ICP0编码序列的polyA信号的下游40bp的HSV-2ICP0序列的质粒。通过用含XhoI的多克隆序列(MCS)替代含Xho I-ICP 0DNA片段的序列来构建pHSV2.ICP0-V。通过将LacZ基因(条纹框)插入pHSV2.ICP0-V的MCS区来产生pHSV2.ICP0-lacZ。通过用在含tetO的hCMV主要立即早期启动子(线盒，CMVTO)控制下的编码UL9-C535C的DNA序列(黑框)替代pHSV2.ICP0-lacZ的指定的含lacZ的片段来构建p02lacZ-TOC535C。通过用在含tetO的HSV-1立即早期ICP4启动子(空心框,ICP4TO)控制下的编码gD2基因的DNA序列(梯度框(gradient box))替代p02lacZTO-C535C 的指定的SnaB I/Pst I 片段来构建p02lacZTO-gD2.C535C。[0023] 图1B显示野生型HSV-2、HSV-2 ICP0无效突变体(N2-lacZ)、N2-C535C和CJ2-gD2的基因组的示意图。UL和US分别表示HSV-2基因组的独特长区域和独特短区域，所述区域侧翼连接它们的相应的反向重复区域(空心框)。以相反的取向用N2-lacZ的lacZ基因和用DNA序列对两个拷贝的ICP0编码序列的替代示于HSV-2基因组的扩展的ICP0编码序列下面，所述DNA序列(1)编码处于N2-C535C中的含tetO的hCMV主要立即早期启动子的控制之下的UL9-C535C和(2)编码处于指定的含tetO的启动子之下的UL9-C535C和gD2。图2A和2B:这些图显示在Vero细胞的CJ2-gD2感染后gD2和UL9-C535C的高水
平表达。在图2A中，模拟(mock)感染或以10PFU/细胞的MOI用野生型HSV-2、N2-lacZ、N2-C535C或CJ2-gD2感染一式两份的Vero细胞。在感染后9小时，制备感染的细胞的提取物。在图2B中，以10PFU/细胞的MO I用野生型HSV-1株系KOS、CJ9-gD、野生型HSV-2或CJ2-gD2感染Vero细胞。在感染后9小时，制备感染的细胞的提取物。将感染的细胞的提取物中的蛋白质在SDS-PAGE上进行分离，随后用抗HSV-1gD(R45)、UL9的多克隆抗体或特异于ICP27和gB的单克隆抗体(Santa Cruz)进行免疫印迹。
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图3:图3显示CJ2-gD2-感染的VCEP4R-28细胞中tetR对gD2和UL9-C535C表
达的调节。以5x 105细胞/60-mm培养皿接种VCEP4R-28细胞。在接种后第40小时，在四环素存在或不存在的情况下，模拟感染或以10PFU/细胞的MO I用野生型HSV-2或CJ2-gD2感染一式两份的细胞。在感染后第9小时制备感染细胞提取物，然后用抗HSV gD和UL9的多克隆抗体以及特异于ICP27的单克隆抗体进行免疫印迹。
[0026] 图4A和4B:这些图显示CJ2-gD2对野生型HSV-2的复制的反式显性阴性效应。在图4A中，用2PFU/细胞的MO I的野生型HSV-2株系186、用2PFU/细胞的MOI的186和5PFU/细胞的MOI的CJ2-gD2、或用2PFU/细胞的MOI的186和5PFU/细胞的MOI的N2-lacZ感染一式三份的Vero细胞。在图4B中，用5PFU/细胞的MOI的野生型HSV-2单独感染、以对于两种病毒都为5PFU/细胞的MOI用186和CJ2-gD2共感染、或用15PFU/细胞的MOI的186单独感染、以及用15PFU/细胞的MOI的186和5PFU/细胞的MOI的CJ2-gD2共感染一式三份的Vero细胞。在感染后第18小时收获感染的细胞，在Vero细胞单层上测定病毒滴度。病毒滴度表示为平均值+/-SD。图顶部的数字表示单独感染与共感染之间野生型病毒产量的倍数减少。
[0027] 图5A和5B:这些图显示在脑内接种后野生型HSV-2、株系186、N2-l acZ、N2-C535C和CJ2-gD2在BALB/c小鼠中的神经毒力。将4至6周龄的雌性BALB/c小鼠随机分配至5个组中，每组8只小鼠。用戊巴比妥钠麻醉小鼠，然后通过在4mm的深度上以20μl的体积脑内注射入脑的左额叶来用DMEM、25PFU/小鼠的野生型HSV-2株系186、1x 106PFU/小鼠的N2-lacZ、2.5x 106PFU/小鼠的CJ2-gD2或N2-C535C接种小鼠。在接种后检查小鼠的疾病的体征和症状，进行35天。图5A显示注射后不同天时的疾病的评分，图5B显示小鼠存活的百分比。
[0028] 图6A和6B:图6A和6B涉及gD2特异性抗体和HSV-2-中和应答的诱导。用DMEM(n=7,6,8,8)假免疫或用CJ 2-gD2(n=7,6,8,8)、N2-C535C(n=7,8,6)或CJ 9-gD(n=6,8,6)以2x 106PFU/小鼠的剂量免疫雌性4至6周龄BALB/c小鼠，2周后进行加强免疫。在初始免疫后4-5周，从小鼠的尾静脉获得血液。在图6A中，将来自单个组的小鼠的血清混合并且加热灭活。测定HSV-2特异性中和抗体的滴度。结果表示为平均滴度±SEM。在图6B中，将来自假免疫的、CJ2-gD2、N2-C535C或CJ9-gD免疫的小鼠的血清与从用表达gD2的质粒p02.4TO-gD2转染的U2OS细胞制备的细胞提取物一起温育。用蛋白A沉淀gD/小鼠IgG特异性复合物，在SDS-PAGE上进行分离，用gD特异性多克隆抗体R45进行探测。
++
[0029] 图7A-7D:这些图涉及HSV-2-特异性CD4和CD8T细胞应答在CJ2-gD2免疫小鼠中的诱导。以2周的间隔假免疫或用CJ2-gD2免疫(2x 106PFU/小鼠)雌性BALB/c小鼠2次。在图7A和7B中，在加强免疫后9-10周，模拟感染或以1x 104PFU/小鼠的剂量用野生型HSV-2皮下感染假免疫的小鼠和免疫的小鼠(n=3)。在攻击后第5天，通过IFN-γELISPOT测定，利用各自纯化的使用Dynal小鼠CD4-和CD8-阴性试剂盒从小鼠脾分离的CD4+和CD8+T细胞分析CD4+和CD8+T细胞应答。在图7C和7D，在加强免疫后5-6周，模拟感染或用野生型HSV-2感染假免疫的和CJ2-gD2免疫的小鼠，然后在感染后第4天进行I FN-γELISPOT测定(n=3)。IFN-γ斑点形成细胞(SFC)的数目表示为平均值±SEM/百万CD4+或CD8+T细胞。
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图8:图8显示用CJ2-gD2免疫的小鼠中攻击性HSV-2阴道复制的减少。将雌性4
至6周龄BALB/c小鼠随机分配至4组，每组10只小鼠。用DMEM模拟免疫或以2x 106PFU/小鼠的剂量用CJ2-gD2、N2-C535C或CJ9-gD免疫小鼠。2周后加强免疫小鼠。第5周，用甲羟孕酮预处理小鼠，然后用5x 105PFU的HSV-2株系G阴道内攻击小鼠。在攻击后第1、2、3、5和7天获取阴道拭样。通过在Vero细胞单层上进行标准噬斑测定来估量拭样材料中的感染性病毒。病毒滴度表示为单个阴道拭样的平均值±SEM。
[0031] 图9A和9B:这些图显示用CJ2-gD2免疫的小鼠中HSV-2疾病的预防。在用野生型HSV-2攻击后，在21天的随访期中观察图8的图例中描述的单个小鼠的生殖器和传播性HSV-2疾病的发病率(图9A)以及存活率(图9B)，使用下列等级：0=无体兆，1=轻微生殖器红斑和浮肿，2=中度生殖器炎症，3=化脓性生殖器损伤和/或全身性疾病，4=后肢瘫痪，5=死亡。
[0032] 图10:图10显示HSV-1UL9-C535C编码序列(SEQ ID NO:2)。UL9-C535C由UL9的氨基酸1-10、Thr-Met-Gly三肽以及UL9的氨基酸535至851组成(参见Yao，等人(69))。[0033] 发明详述
[0034] 本发明基于概念：使用四环素基因开关技术和HSV-1UL9的显性阴性突变体多肽来开发HSV重组病毒，所述HSV重组病毒是复制缺陷型的并且能够抑制野生型HSV感染(显性-阴性)。CJ9-gD为原型显性-阴性、复制缺陷型HSV-1重组病毒并且不依赖于HSV病毒DNA复制地表达高水平的HSV-1主要抗原糖蛋白D(gD)(7)。在其最优选形式中，本发明使用编码2个拷贝的由含tetO的HSV-1主要立即早期ICP4启动子驱动的HSV-2gD(gD2)基因的显性-阴性和复制缺陷型HSV-2重组体(CJ2-gD2)。CJ2-gD2与野生型HSV-2一样有效地表达gD2，并且可在共感染的细胞中对野生型HSV-2的复制产生强大的反式抑制作用。利用CJ2-gD2的免疫引发有效的HSV-2特异性中和抗体以及T细胞应答，并且在小鼠中提供完全的抗野生型HSV-2的阴道内感染的保护作用。
[0035] CJ2-gD2在抗野生型HSV-2生殖器感染和疾病的保护作用方面是比CJ9-gD更有效的疫苗。此外，高剂量的CJ2-gD2的脑内注射不会引起小鼠的死亡或发病。总体来说，这些观察结果表明，CJ2-gD2在抗人的HSV-2生殖器感染和疾病的保护中具有优于常规复制缺陷型病毒疫苗和HSV-2亚单位疫苗的有利方面。[0036] Tet操纵子/阻遏物开关和重组DNA[0037] 本发明涉及，特别地，具有其表达受四环素操纵子和阻遏蛋白调节的基因的病毒。之前已描述了可用于产生包含这些元件和DNA序列的重组DNA分子的方法(参见US 6,444,871;US 6,251,640和US5,972,650)并且包含四环素可诱导的转录开关的质粒是商购可得的(T-RExTM,Inv i trogen,CA)。[0038] 本发明的DNA的基本特征是，可操作地连接至启动子(优选具有TATA元件)的基因的存在。Tet操纵子序列位于启动子的TATA元件中的最后一个核苷酸的3'端的6至24个核苷酸之间和基因的5'端。可将病毒培养在细胞中，所述细胞表达tet阻遏物以阻断基因转录和允许病毒复制。tet阻遏物与操纵子序列的结合强度通过使用包含两个通过2-20，优选1-3或10-13个核苷酸连接的op2阻遏物结合位点(每一个这样的结合位点具有核苷酸序列：TCCCTATCAGTGATAGAGA(SEQ IDNO:1))的操纵子形式来增强。当阻遏物结合该操纵子时，连接的基因不转录或几乎不转录。如果具有这些特征的DNA存在于也表达
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四环素阻遏物的细胞中，那么可阻止病毒感染的基因的转录将被与操纵子结合的阻遏物阻断，并且将发生病毒的复制。[0039] 启动子和基因的选择[0040] 在生产性感染过程中，HSV基因表达基于表达的时间顺序分成3个主要种类：立即早期(α)、早期(β)和晚期(γ)，晚期基因进一步细分成两个组：γ1和γ2。立即早期基因的表达不需要从头病毒蛋白质合成，并且当病毒DNA进入细胞核时被与细胞转录因子一起的病毒体相关蛋白VP16激活。立即早期基因的蛋白质产物被称为感染细胞多肽ICP0、ICP4、ICP22、ICP27和ICP47，并且正是这些基因的启动子优选被用于指导本文中论述的重组基因的表达。
[0041] ICP0在增强HSV从潜伏再活化中起着主要作用，并且以低感染复数赋予病毒显著的生长优势。ICP4是HSV-1的主要转录调节蛋白，其激活病毒早期和晚期基因的表达。ICP27是生产性病毒感染所必需的并且是有效的病毒DNA复制以及病毒γ基因和一个亚组的病毒β基因的最佳表达所需要的。ICP47在HSV感染过程中的功能似乎是，下调主要组织相容性复合物(MHC)I类在感染的细胞表面上的表达。
[0042] HSV-1UL9-C535C的编码区的HSV-1基因组序列的全长序列示于图10(SEQ ID NO:2)中。用于重组病毒的其它序列在本领域中都是公知的。例如HSV-1的全长基因组序列可见于GenBank序列X14112。HSV-1ICP4序列可见于GenBank号X06461；HSV-1糖蛋白D可见于GenBank序列J02217；HSV-2糖蛋白D可见于GenBank号K01408；并且HSV-1UL 9基因可见于GenBank序列M19120(其全都通过引用整体并入本文)。
Tet阻遏物的包含和病毒的产生
[0044] HSV ICP0和ICP4启动子的序列以及其调控受它们内源控制的基因的序列在本领域中是公知的(43,44,56)，并且先前已描述了用于产生包含这些元件的病毒载体的方法(参见美国公开申请2005-0266564)。这些启动子不仅在促进基因表达中非常活跃，而且它们还被VP16(当HSV-1或HSV-2感染细胞时释放的反式激活物)特异性诱导。[0045] 一旦产生适当的DNA构建体，可使用本领域内公知的方法(通常参见，Yao等人(68))将它们整合入HSV-2病毒中。[0046] 免疫方法
[0047] 通常通过将本文中描述的病毒作为疫苗进行注射来将所述病毒用于免疫个体和/或患者。可预防性使用疫苗以预防HSV-1或HSV-2感染或可治疗性使用疫苗以减轻已发生的HSV-1或HSV-2感染的严重性。为了制备疫苗，可将病毒悬浮在任何药学上可接受的溶液中，包括无菌等渗盐水、水、磷酸缓冲盐溶液、1,2-丙二醇、与水混合的聚乙二醇、林格液等。待施用的病毒的确切数目对于本发明不是至关重要的，但应当为“有效量”，即足以引发强度足以抑制HSV感染的免疫应答的量。通常，预期最初施用的病毒的数目(PFU)为1x 107至1x 1010个。
[0048] 可使用标准免疫学方法测试对攻击HSV是有效的抗体的存在，从而估量剂量的有效性以及总体治疗的有效性。可根据需要，重复免疫学注射多次。
[0043]
实施例
[0049]
本实施例描述了HSV-2重组病毒的产生和测定其免疫学效果的测试。
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I.材料和方法
[0051] 细胞
[0052] 在100U/ml青霉素G和100μg/ml硫酸链霉素(GIBCO,Carlsbad,CA)存在的情况下，将非洲绿猴肾(Vero)细胞和骨肉瘤系U2OS细胞培养和维持在补充有10%胎牛血清(FBS)的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM；Sigma Aldrich)中(71)。U2OS细胞能够在功能上互补HSV-1ICP0缺失(71)。U2CEP4R11细胞是维持在DMEM+10%FBS和50μg/ml的潮霉素B中的表达tetR的U2OS细胞(73)。VCEP4R-28细胞是维持在DMEM+10%FBS和50μg/ml的潮霉素B中的表达tetR的Vero细胞(73)。[0053] 质粒
[0054] 质粒pHSV2/ICP0是pUC19衍生的质粒，其编码覆盖HSV-2ICP0开放阅读框架(ORF)的上游268bp至ICP0编码序列的poly A信号的下游40bp的PCR扩增的HSV-2ICP0序列。pHSV2.ICP0-V为HSV-2ICP0克隆质粒，其通过用含有Xho I的多克隆序列(MCS)替代包含ICP0的起始密码子的上游25bp序列至ICP0ORF的终止密码子的上游397bp的Xho I-ICP 0DNA片段而从质粒pHSV2/ICP0产生。质粒pHSV2.ICP0-lacZ通过将pcDNA3-lacZ的含HindIII-Not I-LacZ基因的片段于Hind III-Not I位点处插入pHSV2.I CP0-V而产生。pcmvtetO-UL9C535C是编码在含tetO的hCMV立即早期启动子的控制之下的UL9-C535C的质粒(68)。通过用pcmvtetOUL9-C535C(69)的含有EcoRI/Hind III-hcmvtetO-UL9C535C的片段替代pHSV2.ICP0-lacZ的含EcoR I/Age I-lacZ的片段，构建了表达由含tetO的hCMV主要立即早期启动子驱动的UL9-C535C的p02lacZ-TOC535C(图1A)。
[0055] pAzgD-HSV-2是Dr.Patricia Spear(Northwestern University)馈赠的编码HSV-2gD2的质粒。pICP4TO-hEGF表达处于含tetO的HSV-1立即早期ICP4启动子控制之下的人表皮生长因子，所述启动子由从-377bp至-19bp(相对于ICP4基因的转录起始位点)的HSV-1ICP4启动子序列组成。与质粒pcmvtetO-hEGF(73)中的含tetO的hCMV主要立即早期启动子相似，含tetO的ICP4启动子在ICP4TATA元件TATATGA的下游10bp处包含2个串联拷贝的tet操纵子。因此，与pcmvtetO-hEGF一样，从pICP4TO-hEGF进行的hEGF表达在tetR存在的情况下可受到四环素的密切调控，tetO的插入在tetR不存在的情况下对ICP4启动子的活性没有影响。与pICP4TO-hEGF中的具有tetO的ICP4启动子相关的另外的独特性质是，不存在ICP4DNA结合序列ATCGTCCACACGGAG(SEQ ID NO:3)，所述序列在野生型ICP4启动子中覆盖ICP4基因的转录起始位点(51)。因此，与受到ICP4的自我调节的野生型ICP4启动子(16,57)不同，pICP4TO-hEGF中具有tetO的ICP4启动子将不被HSV-1主要调节蛋白ICP4抑制。
为了克隆处于含tetO的ICP4启动子的控制之下的gD2，我们首先通过将
pICP4TO-hEGF中的含Sma I-Bam HI tetO的ICP4启动子克隆入载体pHSV2.ICP0-V的MCS中来构建质粒p02ICP4-TO。p02.4TO-gD2为p02ICP4-TO衍生的质粒，其编码处于具有tetO的ICP4启动子控制之下的pAzgD-HSV-2的gD2基因。
[0057] p02lacZTO-gD2.C535C是编码处于具有tetO的hCMV立即早期启动子(在hCMV启动子的-236bp处具有5'截断)控制之下的UL9-C535C和处于tetO-ICP4启动子控制之下的gD2基因的质粒(图1A)，其通过用p02.4TO-gD2的含有Hind III/Pst I-gD2的片段替代p02lacZTO-C535C的SnaB I/PstI片段而产生。在p02lacZTO-gD2.C535C中，UL9-C535C
[0056]
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基因和gD2基因的转录处于相反取向。[0058] 病毒
[0059] 在Vero细胞上进行野生型HSV-2，株系186和G的繁殖和空斑试验。N2-lacZ为编码处于HSV-2 ICP0启动子控制之下的Lac Z基因的HSV-2ICP0无效突变体，其中通过用Nhe I-线性化的pHSV2.ICP0-lacZ转染U2OS细胞，然后如先前所述(74)用HSV-2超感染U2OS细胞，从而通过同源重组用pHSV2.ICP0-lacZ中的Lac Z基因替代两个拷贝的ICP0基因。ICP0基因座上Lac Z基因对ICP0基因的替代可利用侧翼于ICP0基因的引物和特异于lac Z基因的引物，通过N2-lacZ病毒DNA的PCR分析来进行确认(41，74)。[0060] N2-C535C是N2-lacZ的衍生物，其中两个拷贝的Lac Z基因都被编码处于质粒p02lacZ-TOC535C的含tetO的hCMV启动子控制之下的UL9-C535C的DNA序列替代(图1B)。简而言之，利用Lipofectamine2000，用线性化的p02lacZ-TOC535C和感染性N2-lacZ病毒DNA共转染U2CEP4R11细胞。利用标准空斑试验，就包含cmvtetOUL9-C535C的DNA序列对N2-lacZ的lacZ基因的重组替代筛选转染的后代。转染后96小时，用5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-吡喃半乳糖苷(X-Gal)对空斑进行染色。分离反映两个拷贝的l acZ基因都被编码UL 9-C535C DNA的序列取代的白色空斑。分离株之一(命名为N2-C535C)在4轮空斑纯化后产生一致的白色空斑。
通过用编码处于具有tetO的hCMV主要立即早期启动子控制之下的UL9-C535C和
处于含tetO的HSV-1ICP4启动子控制之下的gD2的DNA序列替代N2-lacZ的ICP0基因座上的两个拷贝的Lac Z基因来构建CJ2-gD2(图1B)，所述HSV-1ICP4启动子由从-377bp至-19bp(相对于ICP4基因的转录起始位点)的HSV-1ICP4启动子序列组成(71)。[0062] SDS-PAGE和Western印迹分析
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[0063] 模拟感染或用10PFU/细胞的MOI的指定的病毒感染以7.5x 10个细胞/皿接种在60mm培养皿中的Vero细胞。在感染后第9小时或16小时制备细胞提取物(72)。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)(9%丙烯酰胺)分离细胞提取物中的蛋白质，将其转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用抗HSV-1gD的多克隆抗体(R45，Dr s.Gary H.Cohen和Roselyn J Eisenberg的礼物)、抗UL9的多克隆抗体(Mark Challberg的礼物)或特异于ICP27和gB的单克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA)进行探测。[0064] 小鼠
[0065] 4-6周龄的雌性BALB/c小鼠购自Charles River Laboratories (Wilmington,MA)。将小鼠关在金属笼中，每笼4只小鼠，在12小时的光照/黑暗周期下进行维持。使小鼠适应关养环境1周，然后进行实验。按照由哈佛医学院动物区常务委员会(Harvard Medical Area Standing Committee on Animals)和美国兽医协会(American Veterinary Medical Association)批准的方案进行所有动物实验。[0066] 免疫和攻击
[0067] 将BALB/c小鼠随机分成几个组并且修剪它们左后肋上的毛发。使用配备有27规针的1-ml注射器在左后肋以30μl的体积用2x 106PFU/小鼠的CJ2-gD2、N2-C535C、CJ9-gD皮下接种小鼠或用DMEM皮下模拟接种小鼠。2周后对小鼠进行增强免疫，在第2次免疫后3周用野生型HSV-2株系G进行攻击。在攻击之前5天，以20μl的体积用3mg/小鼠的甲羟孕酮(SICOR Pharmaceuticals,Inc.,Irvine,CA)在颈部皮下注射小鼠(7，50)。为了进
[0061]
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行阴道内攻击，麻醉所有组中的小鼠，用藻酸钙拭子(无菌尿道-生殖器藻酸钙镶齿的敷料器，Puritan Medical Produc tscompany LLC,Guilford,Maine USA)预先进行拭抹，然后用20μl含有5x 105PFU(50LD50)的HSV-2株系G的培养基阴道内接种所有组中的小鼠(50)。在麻醉的影响下使小鼠背躺着，且其后部被抬高，在感染后进行30-45分钟。[0068] 急性感染测定和临床观察[0069] 在攻击后第1、2、3、5和7天，用藻酸钙拭抹阴道粘膜(7)。通过标准空斑试验在Vero细胞单层上估量拭样材料中的感染性病毒。在用野生型HSV-2攻击后，在21天的随访期中每天评估小鼠的生殖器损伤和全身性疾病的体征。如下对疾病的严重度评分：0=无疱诊感染迹象，1=轻微生殖器红斑和浮肿，2=中等生殖器炎症，3=化脓性生殖器损伤和/或全身性疾病，4=后肢瘫痪以及5=死亡(8，50)。[0070] HSV-2特异性中和抗体的检测[0071] 在初始免疫后4周，从免疫的和模拟免疫的小鼠的尾静脉收集血液。如之前所述，在补体存在的情况下(5-7)用250PFU的野生型HSV-2株系186测定中和血清抗体滴度。中和抗体滴度表示为达到HSV PFU的50%减少(相对于在培养基+单独的补体中获得的HSV PFU)所需的最终血清稀释度。
免疫沉淀
[0073] 在接种后24小时，利用lipofectamine 2000，模拟转染或用10μgp 02.4TO-gD转染以7.5x 106个细胞/100-mm皿接种的U2OS细胞。在转染后48小时制备细胞提取物(72)。通过将10μl从模拟免疫的小鼠和免疫的小鼠收集的混合血清与70μl的上述制备的细胞提取物混合，进行免疫沉淀。用蛋白A(Pierce Classic IP试剂盒,Pierce Biotechnology,Rockford,IL)沉淀gD/小鼠IgG特异性复合物，将其在SDS-PAGE上分离，用兔抗gD特异性多克隆抗体R45进行探测，然后与缀合有HRP的山羊抗兔IgG(Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA)进行反应。[0074] IFN-γELISPOT测定
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[0075] 以2周的间隔用DMEM假免疫或以2x 10PFU/小鼠的剂量用CJ 2-gD2免疫雌性BALB/c小鼠两次。在第二次免疫后5至10周，模拟攻击或以1x 104PFU/小鼠的剂量用野生型HSV-2株系186皮下攻击假免疫的和CJ2-gD2免疫的小鼠。在攻击后第4或5天，从单个组的小鼠(n=3)分离脾细胞。如先前所描述的(42)，进行CD4+和CD8+T细胞ELISPOT测定。简而言之，使用Dyna l小鼠CD4或CD8阴性分离试剂盒从脾细胞分离CD4+和CD8+T细胞，以7.5x 104或1.5x 105个细胞/孔将所述细胞以一式四份接种在用抗小鼠IFN-γ特异性单克隆抗体(AN18)预包被的96孔过滤板中。在37℃下温育20小时后，洗涤孔，在室温下与生物素化的IFN-γ特异性单克隆抗体(R4-6A2,Mabtech)反应，然后用链霉抗生物素-碱性磷酸酶(Mabtech)进行温育。通过加入BCIP/NBT底物检测IFN-γ点形成细胞。在解剖显微镜下计数点，将I FN-γ点形成细胞(SFC)的数目表示为平均值±SEM/百万CD4+或CD8+T细胞。[0076] 定量实时PCR
[0072]
在加强免疫后16天或用5x 105PFU的HSV-2株系G阴道内攻击后21天，从9或10
只已用CJ2-gD2或CJ9-gD免疫的小鼠收集脊柱的下腰和骶骨部分(包括脊髓和背根神经节)。将脊柱切成4片，每一片分别保持在0.5ml的正常生长培养基中并且于-80℃下贮存，
[0077]
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以待进一步处理。使用DNeasy tissue kit(Qiagen,Santa Clarita,CA)从每一个背根神经节分离总DNA，将其悬浮于400μl AE缓冲液中。如之前所述(8)，利用100ng神经节DNA和特异于HSV DNA聚合酶的引物(正向:5'GCT CGA GTG CGA AAA AAC GTT C(SEQ ID NO:4),反向:5'CGG GGC GCT CGG CTA AC(SEQ ID NO:5))通过实时PCR(Applied Biosystems 7300Real-Time PCR System)定量HSV-2DNA的存在。可容易地检测到的HSV-2病毒DNA的最少拷贝为1个拷贝/反应。[0078] 统计分析
[0079] 为了进行统计分析，进行非配对学生t检验。当P值小于0.05时，结果被认为是统计学上显著的。[0080] II.结果
[0081] CJ2-gD2的构建
[0082] 作为产生表达gD2和UL9-C535C的显性-阴性和复制缺陷型HSV-2重组病毒的第一步骤，我们构建了HSV-2ICP0缺失突变体N2-lacZ，其中HSV-2株系186中的两个拷贝的ICP0基因都被处于HSV-2ICP0启动子控制之下的LacZ基因替代(图1B)。我们显示，与HSV-1 ICP0无效突变体7314(11)类似，N2-lacZ在人骨肉瘤系U2OS细胞上的空斑形成效率为Vero细胞中的425倍，这表明U2OS细胞中的细胞活性也可功能性替代HSV-2ICP0。与野生型HSV-2相比较，N2-lacZ在Vero细胞中的复制效率在0.1PFU/细胞的MOI时降低至1/600以下。与该发现一致，以1x 105和5x 105PFU/小鼠进行的N2-l acZ的阴道内接种导致无局部疾病或全身性疾病，然而用1x 104PFU/小鼠的野生型HSV-2感染的小鼠产生严重的生殖器疱疹，并且到感染后11天为止，全部死亡。此外，N2-lacZ在以5x 105PFU/小鼠的剂量阴道内感染后不能建立可再活化的潜伏感染。这些结果表明，与HSV-1 ICP0(10,11,37,64)类似，HSV-2 ICP0的缺失显著减弱病毒在体内引发急性和可再活化的潜伏感染的能力。
[0083] 为了获得显性-阴性和复制缺陷型HSV-2病毒重组体的gD2表达的最高水平，我们通过用编码由具有tetO的HSV-1主要早期立即ICP4启动子驱动的gD2基因和处于含tetO的hCMV主要立即早期启动子(在hCMV立即早期启动子的全长的-236bp处具有截断)控制之下的UL9-C535C的DNA序列替代N2-lacZ中的两个拷贝的Lac Z基因，构建了显性-阴性和复制缺陷型HSV-2重组体(CJ2-gD2)(图1B)。因此，与在HSV-1UL9基因座上编码单个拷贝的由含tetO的hCMV启动子驱动的插入的HSV-1gD基因的CJ9-gD(41)不同，CJ2-gD2包含2个拷贝的由具有tetO的HSV-1立即早期ICP4启动子控制的gD2基因，所述启动子由从-377bp至-19bp(相对于ICP4基因的转录起始位点)的HSV-1 ICP4启动子序列组成。N2-C535C为HSV-2重组体，其中N2-lacZ中的两个拷贝的Lac Z基因都被处于全长的具有tetO的hCMV立即早期启动子的控制之下的UL9-C535C替代。[0084] CJ2-gD2在感染的Vero细胞中表达高水平的gD2和UL9-C535C
[0085] 为了检查gD2和UL9-C535C分别从具有tetO的HSV-1立即早期ICP4启动子和hCMV立即早期启动子的表达，以10PFU/细胞的MOI用野生型HSV-2、N2-lacZ、N2-C535C和CJ2-gD2感染Vero细胞，在感染后9小时收获细胞。利用HSV-1/2ICP27单克隆抗体、UL9多克隆抗体和gD1多克隆抗体(R45)通过western印迹测定分析感染细胞的蛋白质。由于gB2与gD2一样，是中和抗体以及T细胞应答的主要靶并且为γ1产物，因此也用gB特
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异性单克隆抗体探测感染细胞的蛋白质。图2A显示，CJ2-gD2和N2-C535C表达的HSV-2立即早期蛋白ICP27水平与由野生型HSV-2和N2-lacZ表达的相似。虽然在CJ2-gD2和N2-C535C感染的细胞中检测到显著量的UL9-C535C，但在N2-C535C感染的细胞中几乎未检测到gD2或gB2。然而，与N2-C535C感染相反，CJ2-gD2对Vero细胞的感染导致gD2以高水平表达，与由野生型HSV-2感染的细胞中的gD2的水平相似，并且gD2表达对gB2表达没有影响。结果还表明，与HSV-1 ICP0无效突变体7134(71)一样，N2-lacZ中HSV-2ICP0的缺失大大减少了gD2的表达。由于UL9以极低水平从其真实HSV早期启动子表达(68)，因此在被这4种不同病毒感染的细胞中未检测到野生型UL9。此外，我们观察到，UL9-C535C在CJ2-gD2感染的细胞中的表达水平一致地高于由N2-C535C感染的细胞中的水平，这表明存在于HSV-1ICP4启动子中的HSV VP16效应元件TAATGARAT(71)可导致增强的UL9-C535C从描述的杂合ICP4/hCMV启动子系统的hCMV立即早期启动子的表达。
[0086] 图2B中显示的利用gD1多克隆抗体(R45)的Western印迹分析显示，在野生型HSV-1感染的细胞中检测到比用野生型HSV-2感染的细胞中更高的gD水平，并且在CJ9-gD感染的细胞中检测到的gD水平显著低于CJ2-gD2感染的细胞中的水平。该发现表明，CJ2-gD2表达gD2比CJ9-gD表达gD1更有效。
[0087] 为了证明在CJ2-gD2-感染的Vero细胞中表达的UL9-C535C和gD2确实处于具有tetO的启动子控制之下，我们随后在四环素不存在或存在的情况下以10PFU/细胞的MOI用野生型HSV-2和CJ2-gD2感染稳定表达tetR的Vero细胞系、VCEP4R-28细胞。在感染后第9小时收获来自感染细胞的蛋白质，并通过western印迹分析所述蛋白质。如可观察到的(图3)，虽然在四环素不存在和存在的情况下，在野生型HSV-2和CJ2-gD2感染的VCEP4R-28细胞中都检测到相似水平的ICP27，但仅当四环素存在时在CJ2-gD2感染的VCEP4R-28细胞中检测到UL9-C535C，并且在四环存在的情况下检测到显著更高的gD2水平(与四环素不存在的情况相比)。
[0088] CJ2-gD2不能在Vero细胞中复制
[0089] 由于不存在ICP0并且UL9-C535C从含tetO的hCMV主要立即早期启动子高水平表达，因此CJ2-gD2必须进行构建并且在表达tetR的ICP0互补U2OS细胞系U2CEP4R11中进行增殖(68)。我们在Vero细胞单层上空斑测定了6.65x 107PFU的CJ2-gD2，并且未检测到感染性病毒，这表明与其互补U2CEP4R11细胞相比较，CJ2-gD2在Vero细胞中的空斑形成效率降低至少6.65x 107倍。
CJ2-gD2对野生型HSV-2复制的抑制
[0091] 我们随后通过共转染测定来测试由CJ2-gD2表达的高水平UL9-C535C对野生型HSV-2病毒复制的显性-阴性效应(图4)。图4A显示，5PFU/细胞的MOI的CJ2-gD2和2PFU/细胞的MOI的野生型HSV-2对Vero细胞的共转染导致野生型HSV-2的产量减少至接近1/500(与由相同MOI的野生型HSV-2单独感染的细胞相比较)，无论病毒滴度是在Vero细胞中测定的还是在U2CEP4R11细胞中测定的。当利用N2-lacZ进行相似的共感染实验时，几乎未检测到野生型病毒产量的减少。
[0092] 为了进一步检查CJ2-gD2在抑制野生型HSV-2的复制中的潜能，我们分别以1:1和3:1的MOI比率利用野生型HSV-2和CJ2-gD2进行了共感染实验。图4B中的结果显示，CJ2-gD2在两种条件下在预防野生型HSV-2感染中是有效的，导致与分别用5PFU/细胞和
[0090]
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15PFU/细胞的MOI的野生型HSV-2单独感染的细胞相比较，在指定的共感染比率下野生型病毒合成降至约1/151和1/94。
[0093] CJ2-gD2在小鼠的脑内注射后是无毒力的
[0094] 神经毒力是HSV感染的标志之一。为了测定CJ2-gD2和N2-C535C在CNS中复制的能力，将5至6周龄雌性BALB/c小鼠随机分配至5个组，每组8只小鼠。使用28规胰岛素针将CJ2-gD2和N2-C535C于20μl体积中以2.5x 106PFU/小鼠在左额叶的4mm的深度处直接接种入每一只小鼠脑内(74)。监测发病率和死亡率，进行35天。由于野生型HSV-2株系186的LD50在玻璃体内注射后在雌性BALB/c小鼠中为约10PFU(38)，因此也用25PFU/小鼠的野生型HSV-2接种一组小鼠。作为另外的对照，用1x 106PFU/小鼠的N2-lacZ接种第5组中的小鼠。图5显示，与用DMEM接种的小鼠一样，用CJ2-gD2和N2-C535C以2.5x 106PFU的剂量脑内接种的小鼠在35天的随访过程中未显示神经毒力的体征，然而用野生型HSV-2以25PFU/小鼠的剂量(为给予用CJ2-gD2接种的小鼠的1/100,000)接种的所有小鼠在接种后10天全部死亡，并且所有接种的小鼠都显示通常与HSV-2感染相关的CNS疾病的体征，包括粗糙不平的毛皮(roughened fur)、驼背姿势(hunched posture)、共济失调(ataxia)和厌食症。虽然100%的用N2-lacZ接种的小鼠存活，但所有小鼠都显示脑炎的体征。
[0095] 在用CJ2-gD2免疫的小鼠中诱导HSV-2特异性中和抗体和gD2特异性抗体应答
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[0096] 在用CJ 2-gD2以2x 10PFU的剂量免疫的小鼠中测定CJ2-gD2引发抗HSV-2特异性中和抗体的能力。作为对照，也用相同剂量的N2-C535C或CJ9-gD免疫小鼠的组。如所显示的(图6A)，用CJ2-gD2免疫的小鼠中HSV-2特异性中和抗体滴度的平均值平均为500，其为用N2-C535C免疫的小鼠的3倍(p=0.015)，并且与在CJ9-gD免疫的小鼠中诱导的中和抗体滴度相当(p=0.28)。在1:10稀释度上于模拟接种的小鼠中未检测到抗HSV-2特异性抗体滴度。
[0097] 图6B显示，虽然当用抗gD1抗体R45探测各自免疫沉淀的gD2复合物时，在用CJ2-gD2与CJ9-gD免疫的小鼠之间检测到相似水平的gD特异性抗体应答，但用CJ2-gD2免疫的小鼠中抗gD特异性抗体的水平显著高于用N2-C535C免疫的小鼠和模拟接种的对照中的水平。综合起来，图6中所示的结果表明，由CJ2-gD2产生的gD2的高水平表达导致与N2-C535C相比较，在引发抗gD2抗体以及抗HSV-2特异性中和抗体应答方面增加的功效。[0098] 用CJ2-gD2免疫的小鼠中HSV-2特异性T细胞应答的诱导
为了评估CJ2-gD2免疫在引发HSV-2特异性T细胞应答中的功效，我们进行回忆
实验，以检查在用野生型HSV-2攻击后免疫小鼠中的记忆T细胞应答。首先，在加强免疫后9-10周，模拟攻击或用野生型HSV-2攻击假接种的和CJ2-gD2接种的小鼠，然后在攻击后第5天利用从单组的小鼠(n=3)的脾分离的CD4+和CD8+T细胞进行IFN-γELISPOT测定(图7A)。用野生型HSV-2攻击的CJ2-gD2接种的小鼠与模拟感染的CJ2-gD2免疫小鼠相比较，IFN-γ-阳性CD4+T细胞增加至4.8倍(p<0.0001)。更显著地，在先前用CJ2-gD2接种的HSV-2感染的小鼠中检测到的IFN-γ分泌性CD4+T细胞的数目为HSV-2感染的假接种的小鼠的18倍(p<0.0001)。在相同的条件下在假接种的模拟感染的对照小鼠中未检测到I FN-γ-阳性CD4+T细胞。这些发现显示，利用CJ2-gD2的免疫引发强记忆CD4+T细胞应答。[0100] 虽然与假接种的对照相比较，在CJ2-gD2接种的小鼠中存在2倍的IFN-γ-分泌
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性CD8+T细胞，但在HSV-2感染的假接种的小鼠和HSV-2感染的CJ2-gD2接种的小鼠中检测到相似数目的IFN-γ-分泌性CD8+T细胞(图7B)。因此，我们进行了第二组回忆实验(recallexperiment)，其中在第二次接种后5-6周模拟攻击或用野生型HSV-2(n=3)攻击假接种的和CJ2-gD2接种的小鼠。在感染后第4天进行CD4+和CD8+ELISPOT测定(图7C和7D)。与模拟感染的CJ2-gD2免疫小鼠相比较，在HSV-2感染后在CJ2-gD2免疫小鼠中分别检测到IFN-γ-分泌性CD4+和CD8+T细胞增加至8.6倍和5.7倍(CD4+T细胞:p=0.035；CD8+T细胞:p=0.01)。此外，在用HSV-2攻击后，与假接种的小鼠相比较，在CJ2-gD2接种的小鼠中IFN-γ-分泌性CD4+和CD8+T细胞分别增加至8倍和9.5倍(CD4+T细胞:p=0.036；CD8+T细胞:p=0.01)。总地来说，这些研究显示，利用CJ2-gD2的免疫可引起强劲的HSV-2特异性记CD4+和CD8+T细胞应答，所述应答可在HSV-2感染过程中被有效地回忆。[0101] 免疫的小鼠中抗HSV-2生殖器感染和疾病的保护作用[0102] 在初始免疫后5至6周，用50LD50(5x 105PFU/小鼠)的HSV-2株系G阴道内攻击小鼠。在攻击后第1、2、3、5和7天获取阴道拭样。在21天的随访期中观察小鼠的生殖器和散发性HSV-2疾病的发病率。如图8A中显示的，与模拟免疫的对照(n=10)相比较，在用CJ2-gD2免疫的小鼠(n=9)中，攻击性病毒的产量在第1天降至低于1/200(p<0.001)，并且在第2天降至低于1/130(p<0.0001)。虽然在攻击后第1、2和3天，在用CJ2-gD2和N2-C535C免疫的小鼠的组(n=10)之间，在攻击性病毒脱落的减少上不存在显著差异，但利用CJ2-gD2的免疫在第1天(p=0.03)、第2天(p=0.025)和第3天(p<0.007)在减少攻击性病毒脱落中比CJ9-gD更有效。在攻击后第5天，在用CJ2-gD2、N2-C535C或CJ9-gD免疫的小鼠中未检测到或几乎未检测到攻击性病毒，然而，所有模拟接种的小鼠继续以超过5x 103PFU/ml的平均产量脱落病毒。在3个免疫小鼠组中，在攻击后第7天收集的阴道拭样材料中不存在攻击性病毒。在单独的实验中，我们观察到，虽然在攻击后第5天在CJ2-gD2免疫的小鼠中没有病毒脱落，但在7只N2-C535C免疫的小鼠的5只中和7只CJ9-gD免疫的小鼠的4只中检测到野生型HSV-2的存在。[0103] 图9中的结果显示，用CJ2-gD2免疫的小鼠在用野生型HSV-2攻击后，完全免受局部生殖器损伤的发生并且未显示全身性疾病的体征(图9A)。所有模拟免疫的小鼠在攻击后第11天之前产生严重的生殖器损伤并且遭受野生型HSV-2感染的痛苦(图9B)。虽然利用N2-C535C和CJ9-gD的免疫保护小鼠免受野生型HSV-2的致命攻击，但在N2-C535C和CJ9-gD免疫的小鼠中，分别有20%和30%的小鼠经历短暂的低度局部生殖器疾病(评分1)(表1)。在相似的实验(表1)中，观察到，在用CJ9-gD免疫的小鼠(n=7)中，2只小鼠经历低度的局部生殖器疾病，1只小鼠显示全身性疾病的体征并且在攻击后第14天死亡，7只N2-C535C免疫的小鼠中的3只(43%)显示低度局部生殖器疾病(评分=1)。再次地，在CJ2-gD2免疫的小鼠(n=7)中未看到局部和全身性疱疹性疾病的体征。总地来说，这些研究显示，CJ2-gD2在用野生型HSV-2阴道内攻击后保护小鼠免受生殖器疾病中是比N2-C535C和CJ9-gD更有效的疫苗。
[0104] 表1:在用野生型HSV-2阴道内攻击后在模拟免疫的和免疫的小鼠中抗疱疹疾病的保护作用的百分比
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模拟
实验1(n=9-10) 实验2(n=7-8)
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CJ2-gD2 100% 100%
N2-C535C 80% 57%
CJ9-gD 70% 57%
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参考文献
1.Abu-Raddad，eta al，PLoS ONE 3：e2230(2008).2.Ackcrmann，et al.，J.Virol.52：108-18(1984).3.Adclson，et al.，J.Clin.Virol.33：25-34(2005).4.Arvin，et al.，Infect.Immun.40：184-9(1983).5.Augustinova，et al.，J.Virol.78：5756-65(2004).6.Bournc，et al.，Vaccine14：1230-4(1996).7.Brans，et al.，J.Invest.Dermatol.129：2470-9(2009).8.Brans，et al.，J.Invest.Dermatol.128：2825-32(2008).9.Bryson，et al.，J.nfect.Dis.167：942-6(1993).
10.Cai，et al.，J.Virol.67：7501-12(1993).
[0117] 11.Cai，et al.，J.Virol.63：4579-89(1989).[0118] 12.Cohen，et al.，J.Virol.49：102-8(1984).[0119] 13.Coleman，et al.，J.Clin.Microbiol.18：287-91(1983).[0120] 14.Coopcr，et al.，Cell.Immunol.239：113-20(2006).[0121] 15.Corcy，et al.，N.Engl.J.Med.314：749-57(1986).[0122] 16.DcLuca，et al.，J.Virol.62：732-43(1988).[0123] 17.Dolan，etal.，J.Virol.72：2010-21(1998).[0124] 18.Dudek，et al.，Virology 344：230-9(2006).[0125] 19.Fleming，et al.，N.Engl.J.Med.337：1105-11(1997).[0126] 20.Freeman，et al，Aids 20：73-83(2006).[0127] 21.Glorioso，et al.，J.Virol.50：805-12(1984).[0128] 22.Grammer，et al.，J.Imunol.145：2249-53(1990).[0129] 23.Gupta，et al.，Lancet 370：2127-37(2007).[0130] 24.Handler，et al.，J.Virol.70：6067-70(1996).
[0131] 25.Hirsch，Herpes simplex virus，p.1144-1153.In G.L.Mandell，R.G.J.Douglas，anJ.E.Bcnnctt(ed.)，Principlcs and practicc of infeetious diseases.ChurchiLivingstone Inc.，New York(1990).[0132] 26.Honess，et al.，J.Gen.Virol.22：159-69(1974).[0133] 27.Hoskcn，et al.，J.Virol.80：5509-15(2006).[0134] 28.Johnson，et al.，J.Immunol.145：702-10(1990).[0135] 29.Jones，et al.，Herpes11：12-7(2004).[0136] 30.Kim，et al.，J.Immunol.181：6604-15(2008).[0137] 31.Koelle，et al.，Annu.Rev.Med59：381-395(2008).
17
CN 102666843 A[0138] [0139] [0140] [0141] [0142] [0143]
说 明 书
15/16页
32.Koelle，et al.，Clin.Microbiol.Rev.16：96-113(2003).33.Koelle，et al.，Curr.EyeRes.30：929-42(2005).34.Koelle，et al.，J. Clin.Invest.91：961-8(1993).35.Kousoulas，et al.，Virology166：423-31(1988).36.Lakcman，et al.，Sex.Transm.Dis.13：61-6(1986).
37.Leib，et al.，J.Virol.63：759-68(1989).
[0144] 38.Lcwandowski，et al.，J.Neuroimmunol.81：66-75(1998).[0145] 39.Licsegang，Cornea20：1-13(2001).[0146] 40.Looker，et al.，Sex.Transm.Infect.81：103-7(2005).[0147] 41.Lu，et al.，J.Invest.Dermatol.129：1174-84(2009).[0148] 42.McGeoch，et al.，J.Gen.Virol.69：1531-74(1988).[0149] 43.McGeoch et al.，J.Gen.Virol.72：3057-3075(1991)；[0150] 44.McGeoch et al.，Nucl.Acid Res.14：1727-1745(1986)[0151] 45.McGeoch，et al.，Nuclcic Acids Res 14：3435-48(1986).[0152] 46.Mcrtz，et al.，Ann.Intern.Med.116：197-202(1992).[0153] 47.Mikloska，et al.，J.Gen.Virol.79：353-61(1998).[0154] 48.Mikloska，et al.，J.Immunol.164：5167-76(2000).[0155] 49.Minson，et al.，J.Gen.Virol.67(Pt 6)：1001-13(1986).[0156] 50.Morrison，et al.，Virology243：178-87(1998).[0157] 51.M ullcr，J.Virol.61：858-65(1987).[0158] 52.Nagot，et al.，N.Engl J.Med.356：790-9(2007).[0159] 53.Para，et al.，J.Virol.55：483-8(1985).[0160] 54.Pereira，Dev.Biol.Stand. 52：115-31(1982).[0161] 55.Pereira，et al.，Infect.Immun.29：724-32(1980).[0162] 56.Perry，et al.，J.Gen.Virol.67：2365-2380(1986)[0163] 57.Roberts，et al.，J.Virol.62：4307-20(1988).[0164] 58.Roizman，et al.，Herpes simplex viruses and their replication，p.2399-2459.Ina.P.M.H.D.M.Knipe(ed.)，Fields Virology，4rd ed.Lippincott Williams&Wilkins，Philadelphia，Pa.(2001).
[0165] [0166] [0167] [0168] [0169] [0170] [0171] [0172] [0173] [0174]
59.Schmidt，et al.，J.Infect.Dis.149：645-6(1984).
60.Stanberry，Herpes11(Suppl 3)：161A-169A(2004).61.Stanberry，et al.，Clin.Infect.Dis.30：549-66(2000).62.Stanberry，et al.，N.Engl.J.Med.347：1652-61(2002).63.Starr，et al.，Gene Ther 3：615-23(1996).64.Stow，et al.，J.Gen.Virol.67：2571-85(1986).65.Tiggcs，et al.，J.Virol.66：1622-34(1992).66.Whitlcy，et al.，ClinInfect Dis 26：541-53；quiz 554-5(1998).67.Xu，et al.，.J.Infect. Dis.185：1019-24(2002).68.Yao，et al.，Hum.Gene Ther.10：1811-8(1999).
18
CN 102666843 A[0175] [0176] [0177] [0178] [0179] [0180]
说 明 书
16/16页
69.Yao，et al.，Hum.Gene Ther.10：419-27(1999).70.Yao，et al.，AntiviralRes.53：127-33(2002).71.Yao，et al.，.J.Virol.69：6249-58(1995).72.Yao，et al.，.J.Virol.68：8158-68(1994).73.Yao，et al.，Hum.Gene Ther.9：1939-50(1998).
74.Yao，et al.，Mol.Ther.13：1133-41(2006).
[0181] 75.Zarling，et al.，J. Immunol.136：4669-73(1986).
[0182] 本文中引用的所有参考资料全部通过引用并入本文。虽然已充分描述了本发明，但本领域技术人员应当理解，可在广泛的等同的条件、参数等范围内实施本发明，而不影响本发明或其任何实施方案的精神或范围。
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