一种提高L-异亮氨酸发酵过程糖酸转化率和产率的方法[发明专利]

*CN101967500A*

(10)申请公布号 CN 101967500 A(43)申请公布日 2011.02.09

(12)发明专利申请

(21)申请号 201010527447.6(22)申请日 2010.11.02

(71)申请人天津科技大学

地址300222 天津市泰达开发区13大街29

号(72)发明人陈宁 白亚磊 徐庆阳 谢希贤

刘淑云(51)Int.Cl.

C12P 13/06(2006.01)C12R 1/13(2006.01)

权利要求书 1 页 说明书 2 页

(54)发明名称

一种提高L-异亮氨酸发酵过程糖酸转化率和产率的方法(57)摘要

一种提高L-异亮氨酸发酵过程糖酸转化率和产率的方法。本发明涉及一种发酵法制备L-异亮氨酸的改进方法。本发明根据调整细胞代谢流分配的原理，采用在培养基中添加柠檬酸或其盐的方法，来有效提高L-异亮氨酸发酵过程糖酸转化率和产率。

CN 101967500 ACN 101967500 A

权 利 要 求 书

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1.一种提高L-异亮氨酸发酵过程糖酸转化率和产率的方法，其主要步骤为：采用异亮氨酸生产菌经发酵获得L-异亮氨酸，其特征在于，在培养基中添加柠檬酸或其盐，使其在培养基中的浓度为0.01～10g/L。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是：其中所说的柠檬酸或其盐的浓度为0.05～5g/L。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征是：其中所说的柠檬酸或其盐的浓度为0.1～2g/L。

4.根据权利要求1～3所述的任意一种方法，其特征是：其中所说的柠檬酸盐为柠檬酸钠或柠檬酸钾。

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CN 101967500 A

说 明 书

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一种提高L-异亮氨酸发酵过程糖酸转化率和产率的方法

[0001] 【技术领域】：本发明涉及一种提高L-异亮氨酸发酵过程糖酸转化率和产率的方

法，属于发酵法生产氨基酸的技术领域。[0002] 【背景技术】：黄色短杆菌是工业发酵生产异亮氨酸的常用菌株。在异亮氨酸生产菌生物合成的代谢途径已经清楚的前提下，理论上通过计算可以得出L-异亮氨酸生产的得率在0.486gL-异亮氨酸/g葡萄糖，而目前实际得率仅有约0.18-0.22gL-异亮氨酸/g葡萄糖，较理论值有较大的差距，所以仍具有很大的研究空间。但是，提高糖酸转化率相对于提高产率而言却有相当大的难度。[0003] 近年来，代谢工程领域的研究结果表明，在异亮氨酸生产菌中，糖酵解途径(EMP)相对于三羧酸循环(TCA)过量，即EMP通量超出了TCA代谢的能力，造成碳“溢流”以及过量ATP的合成。那么，连接EMP和TCA的丙酮酸会发生积累，并且会通过其他途径进行代谢以缓解持续的“溢流”。因此，过量碳的溢流会导致有机酸和其他物质的生成。在异亮氨酸生产菌中，分析葡萄糖在胞内的代谢途径，明显可以看到产物L-异亮氨酸的生物合成过程中，HMP途径所提供的能量是十分重要的，这样代谢流在EMP、TCA和HMP之间的合理分配就成为提高L-异亮氨酸产率和糖酸转化率的前提。[0004] 【发明内容】：本发明采用在培养基中添加一定量的柠檬酸或其盐的方法来提高异亮氨酸产生菌L-异亮氨酸发酵过程糖酸转化率和产率。[0005] 柠檬酸或柠檬酸盐可以抑制丙酮酸激酶的活性，减少丙酮酸的积累，造成磷酸烯醇式丙酮酸的积累。从而使磷酸烯醇式丙酮酸转向合成天冬氨酸，进而转向异亮氨酸合成的方向，缓解了EMP和TCA之间的代谢溢流。同时，葡萄糖总通量没有变化，所以更多的葡萄糖进入HMP途径生成了L-异亮氨酸合成所必需的能量，相应的提高了L-异亮氨酸的糖酸转化率和产率。

[0006] 此方法在不增加额外设备和人力投入的情况下，实现了整个发酵周期的缩短和L-异亮氨酸产量和转化率的大幅提高，适合于工业化生产。[0007] 本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

[0008] 本发明提供的一种提高L-异亮氨酸发酵过程糖酸转化率和产率的方法，其特征是：在发酵培养基中添加柠檬酸或其盐，使其在培养基中的浓度为0.01～10g/L，优选0.05～5g/L，更优选0.1～2g/L。其中所说的柠檬酸盐为柠檬酸钠或柠檬酸钾。

[0009] 本发明根据调整代谢流分配的原理提出了适用于提高异亮氨酸生产菌L-异亮氨酸发酵过程中糖酸转化率和产率的方法，它通过降低丙酮酸激酶和磷酸果糖激酶的活力，减弱糖酵解途径通量，降低有机酸的合成，缓解EMP和TCA之间的代谢溢流，使更多的葡萄糖进入HMP途径生成了L-异亮氨酸合成所必需的能量，从而在糖耗相同的基础上，合成较多的L-异亮氨酸，即提高了糖酸转化率。【具体实施方式】：

[0010] 下面通过实施例对本发明作进一步的说明，所举之例并不限制本发明的保护范围：

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CN 101967500 A[0011]

说 明 书

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实施例1：

[0012] 采用的菌株黄色短杆菌；培养基为在现有普遍采用的发酵培养基[葡萄糖8％、硫酸铵0.4％、玉米浆1％、豆饼水解液3％、MgSO4·7H2O 0.1％、FeSO4·7H2O 0.002％、MnSO4·H2O 0.002％、KH2PO4 0.1％、VB1 0.00001％、VH 0.00001％。用NaOH和盐酸调pH至7.0～7.2，115℃灭菌15min]中添加0.1g/L柠檬酸钠；培养方法：将菌种接入种子培养基[葡萄糖3％、酵母粉0.5％、硫酸铵0.5％、豆饼水解液2.5％、玉米浆3％、KH2PO4·3H2O 0.2％、MgSO4·7H2O 0.08％]接种量为5％；在31℃、pH为7.0和溶氧为20％条件下于5L自动控制发酵罐中培养15h至对数期，按10％的接种量接入含有发酵培养基的5L自动控制发酵罐中，控制发酵液温度采用分段控制模式：0～45h为31℃，45～60h为28℃，通入适当空气，调节适当搅拌转速，采用分阶段供氧模式控制溶氧：0～20为25％，20～60h为15％，过自动流加液氨控制pH在7.0～7.2，通过流加适量泡敌消泡，并通过流加浓度为800g/L的葡萄糖溶液将残糖控制在1.5％，发酵至60h停止。放罐时，L-异亮氨酸的产量为26.9g/L，糖酸转化率为18.3％，分别比对照实验(L-异亮氨酸产量为24.5g/L，糖酸转化率为17.11％)提高了9.80％和6.95％。[0013] 实施例2：

[0014] 采用的菌株为黄色短杆菌；培养基为在现有普遍采用的发酵培养基(同实施例1)中添加0.8g/L柠檬酸钠；培养方法同实施例1。放罐时，L-异亮氨酸的产量为27.8g/L，糖酸转化率为18.6％，分别比对照实验(L-异亮氨酸产量为24.5g/L，糖酸转化率为17.11％)提高了13.47％和10.87％。[0015] 实施例3：

[0016] 采用的菌株为黄色短杆菌；培养基为在现有普遍采用的发酵培养基(同实施例1)中添加1.5g/L柠檬酸钠；培养方法同实施例1。放罐时，L-异亮氨酸的产量为29.7g/L，糖酸转化率为19.0％，分别比对照实验(L-异亮氨酸产量为24.5g/L，糖酸转化率为17.11％)提高了21.22％和11.05％。[0017] 实施例4：

[0018] 采用的菌株为黄色短杆菌；培养基为在现有普遍采用的发酵培养基(同实施例1)中添加2.0g/L柠檬酸钠；培养方法同实施例1。放罐时，L-异亮氨酸的产量为31.2g/L，糖酸转化率为19.2％，分别比对照实验(L-异亮氨酸产量为24.5g/L，糖酸转化率为17.11％)提高了27.35％和12.22％。

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