浙江中西医结合杂志２０１４年第２４卷第６期Ｚｈｅｊｉａｎｇ ＪＩＴＣｗＭ（Ｖ０１．２４ Ｎｏ．６ ２０１４） 三七总皂苷诱导Ｕ９３７细胞凋亡及对Ｃａｓｐａｓｅ一３表达的影响 王潇 陈小红尹利明 高瑞兰浙江省中医院杭州３１０００６ 摘要 目的观察三七总皂苷（ＰＮＳ）对人急性单核细胞白血病细胞系Ｕ９３７细胞的增殖、凋亡及 Ｃａｓｐａｓｅ一３表达的影响。方法用不同浓度ＰＮＳ作用于Ｕ９３７细胞，采用Ｍ，ｒｒ法检测细胞增殖活 性，用流式细胞术检测细胞周期和凋亡，Ｗｅｓｔｅｒｎ—ｂｌｏｔ法检测Ｃａｓｐａｓｅ一３蛋白表达。结果ＰＮＳ抑制 Ｕ９４３细胞生长并呈时间和剂量依赖性；分别予１００、２００、４００、８００ｍｇ／Ｌ处理Ｕ９３７细胞４８ｈ，细胞凋 亡率分别为（５．９３￣０．１５）％、（７．４３＿＿－０．７０）％、（１２－３±０．３８）％和（２０．４±Ｏ．９１）％，对照组细胞凋亡率为 （１．７３＋１．５０）％（Ｐ＜Ｏ．Ｏ１），并诱导细胞Ｇ１期阻滞；Ｗｅｓｔｅｒｎ—ｂｌｏｔ结果显示，ＰＮＳ使Ｃａｓｐａｓｅ一３蛋白表 达上调。结论ＰＮＳ能抑制Ｕ９３７细胞增殖，并可能通过上调Ｃａｓｐａｓｅ一３蛋白表达诱导细胞凋亡。 关键词三七总皂苷；Ｕ９３７细胞；凋亡；Ｃａｓｐａｓｅ一３ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｐａｎａｘ Ｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｇ Ｓａｐｏｎｉｓ ｏｎ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ａｎｄ Ｃａｓｐａｓｅ－３ ｉｎ Ｕ９３７ ｃｅｌｌｓ ＷＡＮＧ Ｘｉａｏ，ＣＨＥＮ Ｘｉ— ａｏｈｏｎｇ，ＹＩＮ Ｌｉｍｉｎｇ，ＧＡＯ Ｒｕｉｌａｎ．Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ ＴＣＭ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ（３１０００６￣Ｃｈｉｎａ ＡＢＳＴＲＡＣＴ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｐａｎａｘ ｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｇ ｓａｐｏｎｉｓ（ＰＮＳ）ｏｎ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｃｕｔｅ ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ Ｕ９３７ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃａｓｐａｓｅ一３ ｉｎ ｉｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｕ９３７ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＰＮＳ ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ．Ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｗａｓ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ＭＴＹ ａｓｓａｙ．Ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｗａｓ ａｓｓｅｓｓｅｄ ｂｙ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，ａｎｄ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｃａｓｐａｓｅ一３ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ． Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ Ｕ９３７ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｏｓｅｄ ｔｏ ＰＮＳ ｗａｓ ｉｎ ａ ｄｏｓｅ ａｎｄ ｔｉｍｅ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍａｎｎｅｒ．Ａｔ ４８ ｈｏｕｒｓ ａｆｔｅｒ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｔｏ １００，２００，４００，８００ ｍｒｄＬ ＰＮＳ，ｔｈｅ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｒａｔｅｓ ｏｆ Ｕ９３７ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ（５．９３＋ ０．１５）％，（７．４３￣０．７Ｏ）％，（１２．３＋０．３８）％ａｎｄ（２０．４￣０．９１）％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ ｍａｒｋｅｄｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ（１．７３￣１．５０％，Ｐ＜０．０１）．Ｔｈｅ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｔｏ ＰＮＳ ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｈｅ Ｇ１ ｐｈａｓｅ ａｒｒｅｓｔ ｏｆ Ｕ９３７ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｕｐ—ｒｅｇｕ－ ｌａｔｅｄ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｃａｓｐａｓｅ－３ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ Ｕ９３７ ｃｅｌｌｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ ＰＮＳ ｃａｎ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｕ９３７ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｂｙ ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｃａｓｐａｓｅ一３． ＫＥＹ ＷＯＲＤＳ ｐａｎａｘ ｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｇ ｓａｐｏｎｉｓ；Ｕ９３７ ｃｅｌｌｓ；ａｐｏｐｔｏｓｉｓ；Ｃａｓｐａｓｅ一３ 三七总皂苷（ｐａｎａｘ ｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｇ ｓａｐｏｎｉｓ，ＰＮＳ）是 司；新生牛血清购自杭州四季青公司；二甲基亚砜 从五加科人参属多年生草本植物三七中提取的主要 （ＤＳＭＯ）、四甲基偶氨唑蓝（ＭＴＴ）购自Ｓｉｇｍａ公司； 有效成分，有活血祛瘀，活络通脉等功效。近年来，许 细胞凋亡和细胞周期检测试剂盒购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公 多实验及临床研究发现，ＰＮＳ对肝癌、胃癌、前列腺 司；一抗购自Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｓｚ公司。 癌、妇科肿瘤、黑色素瘤、乳腺癌等多种肿瘤具有抗 １．２主要仪器及设备二氧化碳培养箱（Ｔｈｅｒｍｏ）， 肿瘤作用［１－５］。但ＰＮＳ对人急性单核细胞白血病的研 酶标仪（ＢｉｏＴｅｋ，ＥＬｘ８０８ＩＵ），流式细胞仪（ＢＤ），电泳 究资料甚少。本文采用不同浓度ＰＮＳ作用于人急性 槽、电泳仪、蛋白转印系统（Ｂｉｏ—Ｒａｄ） 单核细胞白血病细胞系Ｕ９３７，观察其对Ｕ９３７细胞 ２实验方法 增殖及凋亡的影响，为进一步研究ＰＮＳ抗白血病作 ２．１细胞培养将Ｕ９３７细胞接种于含１０％新生牛 用提供实验依据，旨在扩展急性髓性白血病的辅助 血清的ＩＭＤＭ培养液中，３７ｏＣ，５％Ｃ０ ，饱和湿度培养 治疗方法。 箱中培养。每２—３天换液１次，取对数生长期的细胞 １实验材料 进行实验。 １．１ 药物及材料 人急性单核细胞白血病细胞系 ２．２分组设实验组和空白对照组。ＰＮＳ按剂量 Ｕ９３７细胞由本实验室保存；ＰＮＳ冻干粉针剂购自广 不同分为５０、１００、２００、４００、８００、１６００、３２００ｍｇ／Ｌ七 西梧州制药有限公司；ＩＭＤＭ培养基购自Ｇｉｂｃｏ公 组，未加药组为对照组。 ４８４ 浙江中西医结合杂志２０１４年第２４卷第６期Ｚｈ￣ｉａｎｇ ＪＩＴＣＷＭ（Ｖｏ１．２４ Ｎｏ．６ ２０１４） ２．３细胞生长抑制率测定采用噻唑蓝（Ｍ３＂ｒ）还原 并诱导细胞凋亡，凋亡率分别为（５．９３－＋０．１５）％、 法进行检测。将ｌｘ１０５／ｍＬ浓度的Ｕ９３７细胞接种于 （７．４３＿＋０．７０）％、（１２．３－＋０．３８）％和（２０．４－＋０．９１）％，对照 ９６孔培养板内，每孑Ｌ ２００１ｘＬ，每组设６个平行孔。分 组细胞凋亡率为（１．７３－＋１．５Ｏ％）（Ｐ＜０．Ｏ１），呈剂量依赖 别作用于２４、４８、７２ｈ后，加入Ｍ｜丌（浓度５ｍｇ／ｍＬ）， 性方式，见表２，图ｌ（封二）。 继续培养４ｈ，吸去上清液，每孔加入ＤＭＳＯ１５０１ｘＬ， 在自动酶标仪上进行比色（测试波长４９０ｎｍ），自动 表２不同浓度ＰＮＳ作用于Ｕ９３７细胞后 细胞周期分布（ｎ＝３， ） ％ 记录每孑Ｌ吸光度（Ｄ）值，计算不同浓度ＰＮＳ对Ｕ９３７ 细胞的生长抑制率：抑制率（％）＝『（对照组ＯＤ值一实 验组ＯＤ值）／对照组ＯＤ值］ｘ１００％。 ２．４流式细胞术（ＦＣＭ）检测细胞周期和凋亡率 收集Ｕ９３７细胞，离心１０００ｒｐｍ，５ｒａｉｎ，去培养基，冷 ＰＢＳ洗涤１次。用１ｘＡｎｎｅｘｉｎ—ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ重悬细 胞约ｌｘ１０６／ｍＬ，取１００ｕＬ，加５ Ｌ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ和１ Ｌ １００ｔｚｇ／ｍＬ ＰＩ，室温５ｒａｉｎ，加４００１，ｚＬ１ ｘＡｎｎｅｘｉｎ—ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ，轻轻混匀，放于冰上，进行ＦＣＭ分析。 ２．５ Ｗｅｓｔｅｒｎ—ｂｌｏｔ法检测Ｃａｓｐａｓｅ一３蛋白 收集细 胞，ＰＢＳ洗涤，抽提细胞裂解液。蛋白上样量４０１ｘｇ， ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳，纤维素膜转移，１％ＢＳＡ封闭， １ｈ。一抗ｌ：１０００稀释，１．５ｈ；二抗１：８０００稀释，１ｈ， ＥＣＬ显影。 ２．６统计学方法数据用（元±ｓ）表示，应用ＳＰＳＳＩＯ．０ 软件进行统计分析，组间比较采用ｔ检验，Ｐ＜０．０５表 示差异有统计学意义。 ３实验结果 ３．１ ＰＮＳ对Ｕ９３７细胞增殖的影响ＰＮＳ对Ｕ９３７ 细胞的生长有明显的抑制作用，并且随浓度增加，作 用时间延长，细胞抑制率明显升高（Ｐ＜０．０５）。不同浓 度ＰＮＳ作用于Ｕ９３７细胞４８ｈ，随着ＰＮＳ浓度增加 抑制率增加，１００ｍｇ／Ｌ以上浓度可明显抑制Ｕ９３７细 胞增殖（Ｐ＜０．０１），见表１。 表１ ＰＮＳ对Ｕ９３７细胞增殖的影响（ｎ＝３，元±ｓ） 注：与对照组比较， Ｐ＜０．０ｌ ３．２ ＰＮＳ对Ｕ９３７细胞周期和凋亡的影响分别用 １００、２００、４００、８００ｍｇ／Ｌ的ＰＮＳ处理Ｕ９３７细胞４８ｈ 后，诱导细胞Ｇｌ期阻滞，停留于Ｇｌ期的细胞增加， ３．３ ＰＮＳ对Ｕ９３７细胞Ｃａｓｐａｓｅ一３蛋白表达的影响 用不同浓度ＰＮＳ作用于Ｕ９３７细胞７２ｈ，Ｃａｓｐａｓｅ一 ３蛋白的表达随浓度增加逐渐上调，见图２（封二）。 ４讨论 肿瘤的发生、发展与细胞凋亡和细胞增殖 紊乱密切相关。细胞凋亡即程序性细胞死亡，主 要有线粒体途径、死亡受体介导途径和内质网应激 介导途径。这三条途径最终都会激活Ｃａｓｐａｓｅ一３， Ｃａｓｐａｓｅ一３是细胞凋亡反应中的执行者和关键酶，直 接参与介导细胞凋亡过程嘲。通过活化脱氧核糖核酸 酶，引起细胞染色体断裂，发生细胞凋亡［７１。Ｃａｓｐａｓｅ一３ 是真核细胞中的凋亡蛋白，属半胱氨酸蛋白酶家族 成员之一，大多数的细胞凋亡与之相关ｆ８ｌ。 ＰＮＳ是中药三七的主要成分，广泛应用于心血 管系统、中枢神经系统、血液系统、免疫系统及抗衰 老等方面 ｑ。近年来，随着国内外学者不断的深入研 究，发现ＰＮＳ具有多靶点抗肿瘤作用，可通过抑制肿 瘤细胞生长、诱导肿瘤细胞凋亡和分化、逆转肿瘤多 药耐药、增强机体免疫功能等多种方式发挥抗肿瘤 作用［１１－１３１。 本实验用ＰＮＳ作用于人急性单核细胞白血病细 胞系Ｕ９３７细胞，实验结果显示，ＰＮＳ可以有效抑制 Ｕ９３７细胞增殖，细胞生长抑制作用随浓度增加及作 用时间增加而增强。细胞周期分析显示，ＰＮＳ可以使 Ｇ１期细胞含量较对照组增高，显示Ｇｌ期阻滞，并呈 浓度依赖性。同时，ＰＮＳ作用于Ｕ９３７细胞４８ｈ后，与 对照组比较，１００、２００、４００、８００ｍｇ／Ｌ组均可显著诱导 Ｕ９３７细胞的凋亡。ＰＮＳ可以使Ｕ９３７细胞Ｃａｓｐａｓｅ一３ 蛋白表达增强，并且随浓度增加蛋白表达增强。 本研究结果表明，ＰＮＳ具抑制Ｕ９３７细胞增殖的 作用，呈时间和浓度依赖性，并能够影响细胞周期， 浙江中西医结合杂志２０１４年第２４卷第６期Ｚｈ￣ｉａｎｇ ＪＩＴＣＷＭ（Ｖｏ１．２４ Ｎｏ．６ ２ｏ１４） ｃｈｅｍ Ｊ，１９９７，３２６（１）：１—１６． 阻滞Ｕ９３７细胞于Ｇ１期，使Ｃａｓｐａｓｅ一３蛋白表达增 强，诱导细胞凋亡。 参考文献 ［７］张剑峰，张丹参．三七总皂苷药理作用研究进展［Ｊ】．医学 综述，２００７，１３（６）：４７２—４７４． ［８］张玉军．三七总皂苷的药理研究进展［Ｊ］．广西医学，２００９， ３１（４）：５８９—５９０． ［１］程馥艳，刘锡文，徐晓武．三七总皂苷对人肝癌细胞ＨｅｐＧ２ 移植瘤增殖的影响及其机制的研究［Ｊ］．河北医科大学学 报，２０１１，３２（４）：４７７—４４９． ［９］万晓青．三七及其制剂在心血管疾病的应用［Ｊ］＿浙江中西 医结合杂志，２００８，１８（１２）：７７６—７７７． ［１０］周小宝．三七皂苷对大鼠脑缺血再灌注损伤细胞凋亡及 相关基因表达的影响［Ｊ］．浙江中西医结合杂志，２００９，１９ （１）：１５—１７ ［２］李军祥，王志斌，朱陵群，等三七提取物对ＭＮＮＧ转化后 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粪质稀薄，日行４～５次，曾于当地中医院诊治后有所 缓解，但此后腹痛腹泻反复发作，每因情绪差，食凉 物或不洁之物而加重，病情迁延不愈。１周前因食物 不洁再发。刻下症见：面色萎黄，畏寒肢冷，大便不成 形，日行４～５次，粪色黄褐而臭，黏滞不爽，肛门灼 热，左下腹疼痛隐隐，喜温喜按，泻后疼痛不缓解。纳 关键词顽固性腹泻；寒热错杂；清温并用；严季澜 欠振，食后腹胀，得矢气则舒，小便正常，寐可，舌红， 苔白腻，脉细。辨证为寒热错杂，虚实兼夹，升降失 腹泻是指每日大便次数增加或排便次数频繁， 调；治以清温并用，通降腑气。拟方：木香６ｇ，元胡、法 粪质稀薄或含有黏液脓血，或含有不消化食物及其 半夏各１０ｇ，厚朴、大腹皮各１５ｇ，陈皮１０ｇ，黄连６ｇ， 他病理性内容物的疾病。腹泻经久不愈或反复发作， 黄柏、苍术各１０ｇ，白术８ｇ，炮姜５ｇ，藿香１０ｇ，白蔻仁 即为顽固性腹泻。该病临床表现为寒热错杂，虚实兼 （后下）６ｇ，茯苓、焦三仙各１５ｇ。７剂，每天１剂，水煎 夹，治疗颇为棘手。严季澜教授为北京中医药大学教 分２次服。２００９年７月１２日二诊：服药后纳食转佳， 授、主任医师、博士生导师，全国名老中医孔光一教 腹胀减轻，大便黏滞不爽除，排便通畅，日行２～３次， 授的学术经验继承人，出身于中医世家，从事中医临 但粪质仍稀溏，左下腹疼痛隐隐，部位固定，喜温喜 床、教学与科研３０多年。笔者读大学期间有幸跟随 按，恶食凉物。舌尖有红点，舌苔薄白，脉细。原方加 严老师临诊４年，现将严老师治疗顽固性腹泻验案 党参８ｇ，干姜５ｇ，莪术６ｇ，枳壳１０ｇ，焦槟榔１５ｇ，继 整理如下，以飧同道。 予１４剂，煎服法同前。２００９年８月（下转第４８９页）
