植物组织细胞培养技术生产次生代谢产物的应用
摘要：植物组织细胞培养是现代生物技术应用最重要的一个方面，它是一个应用广泛和快速发展的技术。植物组织细胞培养技术已应用于植物次生代谢产物的生产，并取得很大成效。本文讲述组织细胞培养技术在药物、食品、化妆品等方面的次生代谢产物生产的一些应用，以及总结了现在主要植物组织培养技术、植物组织培养技术在实践中的应用。
关键词：次生代谢产物 细胞培养 代谢产物
植物的次生代谢产生的活性物质成分已被人类广泛应用，主要集中在研究制药(如如抗癌药物紫杉醇、疗伤药物紫草宁、保健药物人参皂甙等)、食品添加剂(如生姜、香子兰等)、调味剂(如胡椒、留兰香等)、食用色素(如花青素等)、油料(如如豆寇油、春黄菊油等)、饮料(如咖啡、可可等)、树胶(如阿拉伯胶等)、化妆品、生物杀虫剂和农用化学品等方面。尽管有些植物次生代谢物质并不是很多，但它们与人类健康密切相关，已成为当前生物领域研究关注的重点。因此许多植物代谢产物以组织细胞培养技术的方法开发利用，进行大规模生产，使植物次生代谢物质产量和活性提高。
1 植物组织培养技术在实践中的应用[1]
21世纪是生物技术迅速发展的世纪，而植物组织培养技术是生物技术中的重要内容，可以用于：
1.1植物育种 已被越来越广泛的用于扦插难生根植物、引种材料少的植物。除常规的用器官进行培养，也可以用花药进行花粉单倍体植株育种，这种方法技术简单，对一些植物种来说易于诱导未成熟花粉的分裂，可以进行大群体研究，可以迅速而大量的产生单倍体，具有迅速纯合、选择效率高、排除杂种优势干扰、突变体筛选、消除致死基因等优点。
1.2用于脱毒和离体快繁 获得脱除病毒的材料和用于植物材料快速繁殖这方面是目前植物细胞组织培养应用最多最有效的一方面. 世界上受病毒危害的植物很多，而园艺植物受病毒危害更为严重，当植物被病毒侵染后，常常造成生长迟缓、品质变劣、产量大幅度降低等危害，目前，已经在马铃薯、甘薯、草莓、大蒜、苹果、香蕉等多种作物上大规模应用;离体培养的优点就是快速，而且材料来源单一，遗传背景一致，不受季节和地区的限制，重复性好，所以离体快速繁殖已经广泛应用于果树，中药材等的栽培。
1.3在次生代谢产物生产中的应用 用单细胞或细胞团在培养基上进行培养，此方法操作简单、重复性好、群体大等优点，
利用植物细胞组织的大规模培养，可以有效的生产各种天然化合物，如生物碱、蛋白质、糖类、药物、香料天然色素以及其他活性产物，已经专利100多项。
1.4用于保存植物种质资源及其交换 植物种质资源一方面不断大量增加，另一方面一些珍贵的、濒危的的植物资源又日趋枯竭，造成田间保存耗资巨大，又可导致有益基因不断丧失，利用组织培养技术进行离体低温或冷冻保存，可大大节省人力物力及土地，可以挽救那些濒危植物种、珍稀植物种。
1.5在遗传、生理、生化、病理等研究上的应用 已经成为植物科学研究中的常规方法，在植物组织培养的基础上，发展出的一系列遗传转化、突变体筛选、基因转移、DNA直接导入技术已成为基因工程的核心技术，组织培养也成为生物技术的重要组成部分。
2 植物组织细胞培养技术生产次生代谢产物
2.1在药物生产方面的应用
药用植物次生代谢物种类繁多，化学结构迥异。现在已知大约有10000种次生代谢物，包括酚类、黄酮类、香豆素、木脂素、生物碱、糖苷、萜类、甾类、皂苷、多炔类、有机物等。组织培养技术应用在药学方面的工作虽然历史不长，但发展很迅速，它具有如下一些优点：利用组织培养代替原植物的栽培以获得所需的有效成份，达到产量高，成本低的目的，还可节约土地。
2.1.1紫杉醇
紫杉醇是用于治疗卵巢癌、乳腺癌、肺癌的高效、低毒、广普而且作用机理独特的抗癌药物。近年来，临床研究还表明，紫杉醇对其它病症也有一定疗效，如关节炎、先天性多囊肾病、早老性痴呆等[2]。
日本从短叶红豆杉和东北红豆杉中进行组织细胞培养获得较高含量的紫杉醇细胞系植株。我国的研究人员经过多年研究，利用细胞悬浮培养对多种红豆杉不同外植体进行愈伤组织的诱导、培养、筛选出了紫杉醇高产细胞株，并经生物反应器扩大培养含量，细胞生长和紫杉醇含量都相当理想[2]，通过细胞培养技术规模化商业化生产紫杉醇的研究已取得了重大的进展。
2.1.2紫草宁[3]
紫草宁可以用作创伤、烧伤以及痔疮的治疗药物。1974年，Tabata等研究了在哪一种培养基上可使培养细胞产生紫草宁衍生物。1981年Tabata和Fujita等进行悬浮培养，并得到紫草宁衍生物。日本在1983年也用大规模紫草细胞培养来生产紫草宁。国内南京大学生物系从1986年开始研究，得出在适当的培养条件下，培养的紫草细胞悬浮无中紫草宁含量占干重的14%，比紫草根中含量高几倍。
2.2食品生产方面的应用
食品添加剂是食品工业的“灵魂”，食用色素、香精香料、稳定剂、防腐剂、抗氧化剂等既赋予了食品宜人的外观、口感和滋味，又使其在销售期内保持了新鲜状态。
2.2.1薄荷油[3]
目前已经开始采用胡椒薄荷细胞培养技术生产工业薄荷油，但产量很低，这主要是因为菇烯单体的不稳定性及植物毒素的毒性作用而影响到薄荷油的合成。如今，胡椒薄荷中菇烯单体的合成途径已经基本确定。此外，在采用经根癌农杆菌T37转化后的薄荷顶芽培养物，发现薄荷油物质的生物合成与菇烯类物质有关，已测出菇烯类物质是由叶部的油腺所分泌。这些发现必将促进工业薄荷油的生产。
2.2.2香兰素[3]
香兰素(4-羟基-3-甲基苯甲醛)又称香草酚，是香子兰制品中的重要组成成分，香兰素是世界上使用最广的增香剂，已被广泛应用于冰淇淋、饮料、巧克力、糖果、布丁、焙烤食品以及酒类、香烟等食品工业中。，目前主要用于香兰素生产的化学合成法存在许多弊端，采用植物组织培养生产香兰素受到了广泛的关注。研究表明，在香荚豆中的香味成分主要是内源糖苷前体在成熟过程中通过氧化酶的作用而形成的，在组织细胞产香成分的培养过程中，一些关键的酶，如葡萄糖苷酶、多酚氧化酶、过氧化酶的活性都在培养末期达到最高，而且，不同组织器官的细胞培养产生次生代谢物的合成能力有所不同。在香荚兰胚部组织中香兰素生物合成能力最强。通过建立细胞悬浮培养及采用吸附剂如极性(亲水性)树脂或木炭，能够促进产量的提高[3]。美国已经开始采用植物愈伤组织培养技术生产香兰素添加剂，生产成本比化学合成低很多。它是通过建立细胞悬浮培养物以及采取吸附剂来促进产量的提高。
2.2.3花青素[3]
花青素广泛存在于各种植物物种中，主要集中于花，花尊及果实部分，呈现粉红、红、紫及蓝色，用作食品添加剂可获得诱人的自然的红色。随着国际社会对健康的重视，很多合成色素因使用安全问题被禁用，低毒性的天然花青素就有着巨大的应用潜力。在1987年与1989年Iiker和Francis建议将植物细胞培养的天然花青素产品制品作为合成花青素的替代产品。有许多厂家和研究机构从事从各种植物细胞中生产天然色素的生产研究，并取得很大的进展。Harigae Yasushi用选择可见高产细胞团的方法，在MS培养基上挑选出繁殖快的高产花青素葡萄细胞系，在30L的小型发酵罐中培养，粗花青素产率达到0.3% ；Kobayashi，Yashinori等在光照条件下悬浮培养花青素的土当归细胞，在SOOL发酵罐中培养16d收获细胞，细胞重量增加26倍，花青素产量5倍，占细胞干重的17.2%。随着研究工作的进一步深人，植物细胞培养花青素将进人工业化阶段。目前已有报道的能生产花青素的植物有：大戟属、翠菊属、甜生豆、矢车菊属、玫瑰花、紫菊属、苹果、葡萄、胡罗卜、野生胡罗卜、葡萄藤、土当归、商陆、筋骨草属、靶苔属等。报道过的能用植物细胞培养生产的色素有胡罗卜素、叶黄素、单黄酮体等。
2.3在化妆品方面的应用[5]
植物的次生代谢产物是化妆品原料的重要来源，在美国CTFA (美国化妆品盥洗用品和香精协会)化妆品原料手册和日本功能性化妆品原料手册中选用的植物提取物及代谢产物的数量都占有较大比例。紫草提取物在化妆品中用作收敛剂， 1983年日本三井石油化学公司采用两步法培养紫草细胞，成功实现工业化生产。1984年该公司和钟纺公司利用紫草宁色素研制出了世界第一支生物口红。人参提取液是一种皮肤细胞活化剂，可以应用于系列化妆品的生产，日本电工公司自20世纪80年代末一直进行人参细胞大规模商业化生产。
2.4其他方面的应用
2.4.1茶树次生代谢产物[6]
茶树次生代谢产物如多酚类物质、咖啡碱、茶氨酸和菇烯类物质等不仅是重要的植物天然产物，也是构成茶叶滋味、香气的特征品质成份，可广泛用于食品、医药等行业。如何开发利用这些天然产物已成为近年茶叶科学研究的热点领域之一。
七十年代，原苏联等科学家对茶愈伤组织中酚类化合物及黄烷醇类含量随生长而积累的规律及影响次生代谢产物形成的激素、前体及光等影响因素进行了研究。国内研究起步较晚，九十年代研究人员对适合于茶愈伤组织生长及儿茶素积累的培养基中无机及有机成分、激素含量、PH条件和品种间差异等内容进行了研究；利用茶愈伤组织培养生产茶氨酸的产量可达干重的20%；利用茶愈伤组织培养还可生产可可碱和咖啡碱。综观这些研究，发现利用茶愈伤组织培养生产次生代谢产物是可行的，但茶愈伤组织培养生产儿茶素的能力大幅度降低，同时丧失了形成复杂的醋性儿茶素的能力；不同培养方式、不同培养基条件对产量影响较大，有些细胞系的儿茶素含量已超过原材料，说明了筛选高产细胞系的可能性；利用愈伤组织合成儿茶素的时间仍较长，固体培养条件下需六周才达到高峰，而悬浮培养则只需2025天；有关茶愈伤组织培养生产次生代谢产物的工艺学内容的研究涉足较少。由此看来，利用茶愈伤组织培养生产次生代谢产物的工业化生产尚不具备条件，筛选稳定高产的细胞系、提高次生物质的产量是关键所在，而工艺学内容的研究则是工厂化的前提。
2.4.2长春花[7]
长春花培养生产生物碱长春花是夹竹桃科长春花属植物。20世纪50年代人们发现其细胞和组织培养物中含有100多种次生代谢产物，其中大多为生物碱。它们的天然含量较低，但具有很强的生物活性，是目前应用最广的天然抗癌药物之一。利用组织培养和细胞工程技术筛选高产细胞系和用毛状根的培养生产各种长春花生物碱成了目前研究的热点。在细胞培养中加入前体物质如马钱子甙，诱导子如茉莉酮酸、甲壳质、果胶酶等均能提高长春花次生代谢产物的积累量。Zhao等在培养长春花细胞的系统中加入KCl、甘露糖、前体物质(琥珀酸色氨和色氨酸)和一些生物代谢调节物后，观察到处理后细胞产生的长春花碱和西萝芙木碱是未经处理的4倍多。目前对长春花生物碱的基本代谢模式已比较清楚，但是其中关键限速酶还在研究之中。研究色氨酸合成酶和色氨酸脱羧酶在长春花细胞合成吲哚类和喹啉类生物碱中的作用发现采用基因工程方式超量表达这两种酶后，生物碱产量超过200 mg/L，表明这两种酶对长春花生物碱合成速度的重要性。近年来，毛状根培养技术在植物次生代谢产物生产中的广泛应用，使得长春花的毛状根培养越来越多研究。
3 植物组织细胞培养技术的展望
3.1现在主要植物组织培养技术[8]
现在主要的植物组织培养技术研究和应用得比较多的有以下方面：
3.1.1固定化培养技术 植物细胞固定化是将植物细胞包裹于一些多糖或多聚化合物上进行培养，并生产有用代谢物的技术。与悬浮培养相比，它具有提高反应效率、延续反应时间及保持产物生产的稳定性等特点。
3.1.2两相培养技术 在培养体系中加入水溶性或脂溶性有机物或者具有吸附作用的多聚物使培养体系分为上下两相，细胞或组织在水相中生长和合成次生代谢物质，次生代谢物质分泌出后再转移到有机相中，然后再从有机相分离植物次生代谢物的技术，称为两相培养技术。
3.1.3 反义技术 根据碱基互补原理，人工合成或生物体合成特定互补DNA或RNA片段，抑制或封闭某些基因表达的技术，通过此技术，可以将反义DNA或RNA片段导入植物细胞，使催化某一分支代谢的关键酶活性受抑制或加强，从而提高目的物的含量，同时抑制其他化合物合成。
3.1.4冠瘿培养技术 利用根癌农杆菌感染植物可以将Ti质粒的T-DNA片段(含有诱导冠瘿组织发生的tms基因和tmr基因)整合进入植物细胞的基因组，诱导细胞冠瘿组织的发生。
3.1.5毛状根培养技术 毛状根是双子叶植物各器官受发根土壤杆菌感染后产生的病态组织。感染过程中，发根农杆菌Ti质粒T- DNA转移并整合到植物基因组中。具有激素自养，增殖速度快，次级代谢产物含量高且稳定等特点。
3.1.6添加诱导子或引导物技术 诱导子是一种能引起植物过敏反应的物质，当它在与植物的相互作用时，能快速、高度专一和选择性地诱导植物特定基因的表达，进而活化特定次生代谢途径，积累特定地目的次生代谢物，从而提高植物次生代谢产物的产量。
3.1.7植物细胞悬浮培养生物反应器技术 生物反应器技术具有很多优点：工作体积大、单位体积生产能力高、物理和化学条件控制方便等。
3.2展望
组织细胞培养技术是现代生物技术最重要的应用技术之一，它是生物技术最直接的体现，它的快速发展和广泛应用不断促进了生物技术的发展和推动人类科学技术的前进，将更大的服务于人类。特别是植物组织细胞培养技术的应用已经取得很大成绩，正在快速的利用和发展之中。
尽管植物愈伤组织培养技术工业化生产次生代谢产物还存在许多问题，如存在产量低，周期长，代谢调控知识的缺乏等问题。但通过近几年的努力，取得相当大进展。我们相信未来植物细胞培养一定会有所突破，将会被应用到更多方面。
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