AMAMFSAc18016 牛奶 蛋白质 染料结合法
AM-AM-FS-Ac-18016
牛奶中的蛋白质
1.仪器和试剂
1.1 仪器
(a)分光光度计——光电比色计或固定在480nm波长的分光光度计。用相当于0.350，0.600，0.750和0.850g/L的试剂染料溶液的缓冲稀溶液来校准分光光度计。以A对浓度作图，为标准曲线。
(b)短光程池——光程长度约为0.3mm的液池，流通型更为方便。在370nm处测量0.05N KOH中0.0400g K2CrO4/L溶液。从公式b=As/0.09914计算光程长度6mm。需安装排水管和给水管，即使有也要根据厂家的说明书确保适当的流速和水位。
适用的短光程比色计，流通池和校正曲线都可买到。
(c)自动滴定计——在20℃，调到放出40.44g试剂染料溶液(相当于39.887gH2O；40ml)。调节到10次连续放出量都在40.44士0.02g之间。
(d)注射器——在20℃时进样量为2.24ml的标准的样品注射器 (相当于2.2337g H2O)。
(e)聚乙烯塑料袋——6oz或相当的。
1.2 试剂
(a)提纯酸性橙12——将100g染料溶于400ml沸水，并在400ml沸腾的变性酒精中搅拌。在0—5℃冷却大约15h。用布氏漏斗过滤，用冷酒精洗一次，连续抽气直到把酒精除去，在125℃干燥;重结晶，在100℃真空箱 中干燥。
(b)试剂染料溶液——(1)配方I——将1.300g(分析校正的)二次重结晶酸性橙12溶于1L 0.05M磷酸缓冲液(d)。(2)配方II——将1.320g(分析校正的)二次重结晶酸性橙12溶于1L含60ml HOAc和10g草酸的溶液中。
利用公式C=A(5.90×6)，由A计算溶液中染料的浓度C来进行分析校正，式中b是液池的光程长度mm。根据已知蛋白质含量的牛奶或预先定值的染料溶液进一步检查溶液 (对于分析和标定必须使用同样的染料配方)。
(c)参比染料溶液——将0.600g二次重结晶的酸性橙12和1ml丙酸溶于约900ml H2O。用水稀释到1L，用上述 (b)进行分析校正。
(d)0.05M磷酸缓冲液——pH1.8—1.9。将3.4gKH2PO4，3.4ml H3PO4(1(85%)+1)，60ml HOAc，1ml丙酸和2g草酸溶于约800ml H2O中，用H2O稀释到1L。
2.试验过程
2.1.样品的制备
(a)牛奶，冰淇淋混合物——作标准用。
(b)一半对一半的脱脂酸奶巧克力饮料——加热到35—38℃，并充分搅拌。
(c)脱脂干奶(NFDM)——用粉末或用按下列步骤复制的样品:称塑料袋，准确到0.5mg。加1平匙NFDM(约7.5g)再称重。加大约75ml(约60℃)的H2O，封住袋子用力摇3min。冷却到室温，不要使用水浴。再次称重。冷冻过夜。对各次重复实验，重新配一份新的NFDM样品。
2.2.测定
将分光光度计调零;调参比染料溶液 (c)在480nm处读数为42%T，用注射器把2.24ml牛奶，脱脂酸奶，或2.5—2.8ml1半对半的巧克力饮料或重新配制的NFDM，或2.0—2.3g冰淇淋混合物，或0.22—0.24gNFDM粉末放入带有螺旋盖丙衬玻璃纸的挤压型聚乙烯2oz配量瓶中。测定样品重量到0.5mg，用自动滴定计向瓶中加40.44g试剂染料溶液(b)，用力摇30s，装有NFDM粉末的瓶子要摇3min。如果必要、重新将参比染料溶液的读数调到42%T。从配量瓶把滤液滴入浮选漏斗并吸入液池中。当读数不变时，记录数据，精确到0.1%，避免视差。检查分光光度计。如某参比染料溶液的读数不是42%，调整仪器，重读样品。
全部溶液放入池中时，必须是25士1℃。在读数前测量温度;在仪器内溶液会变热。
2.3.计算
(a)对配方I——利用仪器备有的校准图，从所得到的读数来测定样品滤液中染料的浓度(mg/ml)。体积=(1/1.012)×(样品克数+40.44);未结合的染料毫克数=体积×染料浓度;结合的染料毫克数=52毫克有效染料－未结合的染料毫克数。蛋白质毫克数=结合的染料毫克数/0.312。
蛋白质%=蛋白质毫克数/(样品克数×10)
NFDM中蛋白质%=重新配制的NFDM中蛋白质%×重新配制的NFDM克数/所用NFDM样品克数。
(b)对配方II——用仪器备有的校准图，从所得读数测定样品滤液中染料的浓度(mg/ml)。
蛋白质%=(1.250－样品染料浓度)/0.1824
3.来源
AOAC 官方方法967.12（第17版）