基因在染色体上的理论基础由萨顿提出，他通过观察基因与染色体在遗传过程中的行为相似性，得出基因位于染色体上的假说。基因在杂交过程中保持完整性和性，与染色体的配子形成和受精过程也表现出相对稳定的形态结构。在体细胞中，基因和染色体均成对存在，而配子中则仅保留一对中的一方。体细胞中基因一个来自父方，一个来自母方，同源染色体亦然。非等位基因在配子形成时自由组合，非同源染色体在减数第一次后期也是自由组合的。萨顿的推理属于类比推理，结论的正确性还需通过观察和实验验证。
果蝇因其易饲养、繁殖快的特性，常被用作遗传学研究的实验材料。摩尔根通过果蝇杂交实验验证了基因位于染色体上的理论，并发现了基因的连锁互换定律，这被认为是遗传学的第三定律。摩尔根还证实了基因在染色体上呈线性排列，为现代遗传学奠定了细胞学基础。
每种生物的基因数量通常远多于染色体数目，一条染色体上包含许多基因，基因在染色体上呈线性排列。现代分子生物学技术通过特定分子与染色体上的基因结合，并利用带有荧光标记的物质识别，能准确显示基因在染色体上的位置。细胞遗传学研究揭示，孟德尔的遗传因子理论与位于同源染色体上的等位基因相对应，而非同源染色体上的非等位基因则遵循自由组合定律。
作为遗传物质的DNA也位于染色体上，每条染色体包含一个DNA分子。在细胞时，DNA复制并随染色体平均分配至两个子细胞。DNA由脱氧核苷酸连接成的长链构成。人类体细胞中有23对染色体，其中1号至22号为常染色体，第23号为性染色体。摩尔根的实验不仅验证了基因的连锁互换定律，还进一步证明了基因在染色体上的线性排列，为遗传学的发展做出了重要贡献。
