骨髓炎的确诊需要结合临床症状、实验室检测和影像学检查。最权威的诊断手段是通过活检取得死骨进行组织学和微生物学分析。体检时应留意皮肤和软组织的状态，确定压痛点，检查骨骼的稳定性，评估肢体的神经血管状况。实验室检测结果通常不具备特异性，无法准确反映感染的严重程度。大多数患者血沉（ESR）和C-反应蛋白（CRP）会升高，但白细胞计数上升的比例仅约35%。
对于慢性骨髓炎患者，可以使用多种影像技术进行检查，但没有一种方法能绝对肯定或排除骨髓炎。影像学检查主要用于辅助诊断和术前规划。X光片能提供诊断慢性骨髓炎的关键信息，首次检查应包括这项。皮质骨破坏和骨膜反应强烈提示骨髓炎的存在。尽管断层扫描过去是常规检查手段，但现在已经不常用，它在发现死骨方面仍然很有帮助。如果存在窦道，进行窦道造影对于制定手术方案非常有用。
锝99骨扫描对诊断急性骨髓炎非常有效，但对于慢性骨髓炎则效果不佳。急性骨髓炎在X光片上通常没有异常表现。骨内血流增加或成骨活性增加的区域在锝99骨扫描上表现为吸收增加，但缺乏特异性。然而，该检查具有较大的阴性排除作用，尽管也有假阴性报告。镓扫描在白细胞或细菌聚集区表现为吸收增加。如果镓扫描结果正常，可以确定没有骨髓炎。术后使用镓扫描进行随访也很有用。
铟111标记白细胞扫描比锝扫描和镓扫描更敏感，对鉴别慢性骨髓炎和糖尿病性神经病足方面非常有用。CT扫描能够清晰显示皮质骨，观察周围软组织，特别适用于检查死骨。MRI在软组织成像方面优于CT，且能很好地显示骨的水肿区。慢性骨髓炎在MRI图像上常表现为界限清晰的高信号区，周围有活跃病灶（环形征）。窦道和蜂窝织炎在T2加权像上显示为高信号区。
